自噬对脂多糖致大鼠急性肺损伤模型的炎症调控

目的探讨自噬在脂多糖致大鼠急性肺损伤炎症调控中的作用。方法 30只Wistar大鼠随机分为生理盐水对照组(对照组)、肺损伤组、自噬抑制组,每组10只;对照组静脉注射生理盐水10mL,肺损伤组静脉注射5mg/kg脂多糖,自噬抑制组静脉注射5mg/kg脂多糖后给予15mg/kg的3-甲基腺嘌呤;24h后检测各组肺组织湿干比,评价肺水肿的程度;HE染色观察肺组织病理学变化并进行肺损伤评分;采用ELISA法检测血清和肺泡灌洗液中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)表达水平;采用荧光定量PCR法检测自噬基因LC3B和Beclin-1的mRNA表达情况。结果肺损伤组和自噬抑制组肺水肿和肺损伤程度较对照组明显加重,肺损伤组较自噬抑制组明显减轻;肺损伤组LC3BmRNA(3.02±0.35)和Beclin-1mRNA(2.67±0.28)表达水平明显高于对照组(1.24±0.12、1.13±0.07)(P0.05)和自噬抑制组(0.86±0.17、0.57±0.06),对照组高于自噬抑制组(P0.05);自噬抑制组肺组织湿干比(4.82±0.50)和病理学评分(3.86±0.34)高于肺损伤组(4.17±0.46、3.24±0.57)和对照组(2.26±0.35、1.18±0.26),肺损伤组高于对照组(P0.05);肺损伤组血清及肺泡灌洗液中MPO[(1.27±0.32)、(0.64±0.14)ng/L]、MIP-2[(0.72±0.10)、(0.11±0.02)ng/L]、IL-1β[(4.29±0.32)、(1.53±0.17)ng/L]和TNF-α水平[(1.48±0.27)、(1.27±0.22)ng/L]水平均低于自噬抑制组[MPO(1.69±0.53)、(1.07±0.26)ng/L,MIP-2(1.07±0.14)、(0.16±0.04)ng/L,IL-1β(5.38±0.66)、(1.98±0.35)ng/L,TNF-α(2.02±0.17)、(1.69±0.21)ng/L)](P0.05)。结论自噬对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤可产生内源性保护作用,机制与其抑制炎性因子浸润有关。     

小剂量氢化可的松与血必净对急性肺损伤大鼠作用比较

目的观察小剂量氢化可的松与血必净注射液对大肠埃希菌导致的大鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用。方法大肠埃希菌[O111B4,(4.4~5.6)×1012CFU/L]3 ml/kg气管注射制作大鼠肺内源性ALI模型,设氢化可的松干预组[HC组,腹腔注射氢化可的松5 mg/(kg·d),共2天]、血必净干预组[X组,腹腔注射血必净注射液5 ml/(kg·d),共2 d]、模型对照组[C组,腹腔注射生理盐水5 ml/(kg·d),共2天]、正常对照组[N组,气管注射3 ml/(kg·d)生理盐水,腹腔注射生理盐水5 ml/(kg·d),共2天]。各组分别于末次给药后12 h放血处死动物,留血清测TNF-α、IL-8水平。取左肺计算肺指数。结果 (1)HC组、X组、C组病死率无统计学意义(χ~2=0.194,P=1.000);(2)TNF-α水平:HC组及X组[分别为(80.31±11.87)ng/L,(89.42±22.76)ng/L]均明显低于C组[(125.68±27.91)ng/L](P<0.05),HC组与X组差别无统计学意义(P>0.05);(3)IL-8水平:HC组与X组[分别为(175.01±40.29)ng/L,(214.38±56.03)ng/L]均明显低于C组[(266.48±56.09)ng/L](P<0.05),HC组与X组差别无统计学意义(P>0.05);(4)肺指数:HC组与X组[分别为(0.318±0.058)%,(0.352±0.046)%]均明显低于C组[(0.412±0.055)%](P<0.05),HC组与X组差别无统计学意义(P>0.05)。结论小剂量氢化可的松及血必净治疗大肠杆菌导致的大鼠ALI均能明显降低血清促炎因子的水平,减轻肺水肿,两者作用相似。     

褪黑素对小鼠肝癌细胞自噬功能的影响及机制

目的探讨褪黑素对小鼠肝癌细胞自噬信号通路的影响及作用机制。方法 BALB/c小鼠30只,随机分为对照组、10mg/kg褪黑素组、20mg/kg褪黑素组各10只,3组均皮下注射接种小鼠肝癌H22细胞株,接种剂量为1×10~6细胞/100μL,10mg/kg褪黑素组、20mg/kg褪黑素组分别腹腔注射10、20mg/kg褪黑素0.2mL,1次/d,连续14d,对照组注射等量生理盐水;腹腔注射后14d处死小鼠,取出肿瘤组织,电镜下观察自噬液泡总数,荧光显微镜下计算微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)-Ⅱ阳性细胞占总细胞数的百分率,Western blot法检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-1、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,P-Akt)和哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,P-mTOR)表达水平。结果腹腔注射后14d,10、20mg/kg褪黑素组自噬液泡总数[(9.00±2.00)、(11.00±2.00)个]、LC3-Ⅱ阳性细胞百分率[(33.33±10.41)%、(39.67±8.52)%]均高于对照组[(3.00±1.00)个、(10.76±9.17)%],20mg/kg褪黑素组高于10mg/kg褪黑素组(P0.05);腹腔注射后14d,10、20mg/kg褪黑素组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值(51.75±10.82、46.32±8.24)、Beclin-1水平(82.74±16.52、81.63±18.07)均高于对照组(3.45±1.76、17.33±8.62),10 mg/kg褪黑素组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值高于20mg/kg褪黑素组(P0.05),Beclin-1水平与20mg/kg褪黑素组比较差异无统计学意义(P0.05);10、20mg/kg褪黑素组P-Akt/Akt(38.29±7.88、46.57±9.96)、P-mTOR/mTOR值(28.77±8.16、37.84±6.76)均低于对照组(112.46±8.95、108.85±6.74),10mg/kg褪黑素组低于20mg/kg褪黑素组(P0.05)。结论褪黑素可通过上调Beclin-1表达,抑制Akt、mTOR的磷酸化来抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活化,进而促进细胞自噬。     

血必净注射液对急性肺损伤兔炎性介质及内皮功能影响的实验研究

目的:探讨血必净注射液对急性肺损伤(ALI)兔炎性介质的影响及其内皮功能的保护作用.方法:采用随机分组对照试验方法.取24只新西兰兔随机分为3组,每组8只.空白对照组予静脉注射生理盐水2mL/kg,ALI组予静脉注射内毒素0.5 mg/kg,血必净治疗组在静脉注射内毒素0.5 mg/kg后给予静脉注射血必净5 mL/kg.分别测定3组0 h、8 h时点的血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平,并在光镜下观察实验兔的组织形态改变和测定肺组织W/D比值.结果:8 h后ALI组肺脏体积增大.光镜下见肺组织内大量白细胞浸润,肺间质水肿明显,肺泡腔及间质可见血性渗出液.ALI组肺组织W/D比值、血清TNF-α、IL-6明显升高.血必净治疗组肺组织W/D比值、血清TNF-α、IL-6亦有升高,但明显低于ALI组(P<0.001).与ALI组比较,血必净治疗组肺间质、肺泡水肿及肺出血情况明显减轻.结论:血必净注射液具有拮抗炎性介质和保护内皮功能的作用.     

血必净注射液对内毒素诱导急性肺损伤大鼠γ-干扰素/白细胞介素-4失衡的影响

目的 探讨血必净注射液对急性肺损伤(ALI)大鼠γ-干扰素/白细胞介素-4(IFN-γ/IL-4)比值失衡的影响.方法 将56只SD大鼠随机分为对照组、模型组和血必净组,后两组又分别分为给药后1、2、4 h 3个亚组,每个亚组8只.采用舌下静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg建立ALI模型,血必净组注射LPS后腹腔注射血必净注射液10 ml/kg,模型组、对照组腹腔注射等量生理盐水.检测各组肺湿/干重 (W/D) 比值及血清IFN-γ、IL-4的水平和IFN-γ/IL-4比值.结果 模型组给药后各时间点肺W/D比值、血清IFN-γ、IL-4水平和IFN-γ/IL-4比值均较对照组显著升高(均P<0.01);血必净组大鼠肺W/D比值、血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4比值均较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01),血清IL-4水平均显著升高(均P<0.01).结论 血必净注射液可使LPS所致ALI大鼠失衡的IFN-γ/IL-4比值趋于平衡,减轻大鼠ALI的程度.     

自噬在急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡中的作用研究

目的探讨自噬对急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡的作用。方法 24只雄性SD小鼠随机分为假手术组(S组)、脓毒症组(Sep组)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(Sep+3-MA组)。采用脂多糖气管滴注法制备ALI模型。在光镜下评估小鼠肺组织病理学损伤评分并计算肺湿干质量比值(W/D), 通过流式细胞术检测小鼠气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中Th17细胞和Treg细胞计数及其相关细胞因子的水平, 用Western blot法测定BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62的表达。结果与S组比较, Sep组和Sep+3-MA组肺组织病理学评分、W/D比值升高(P<0.05);与Sep组比较, Sep+3-MA组BALF中Th17细胞计数下降, Treg细胞计数随着脓毒症的发展明显升高(P<0.05), IL-17、IL-10和TNF-α的水平均明显下降(P<0.05);而TGF-β1的水平在脓毒症的早期升高, 而随着脓毒症的发展, TGF-β1的水平明显下降(P<0.05)。与S...     

多不饱和脂肪酸对骨关节病软骨细胞自噬的影响及机制研究

目的 探讨多不饱和脂肪酸对人骨关节病(OA)软骨细胞自噬的影响及其促进自噬的作用机制。方法纳入2019年5在首都医科大学附属北京友谊医院骨科接受髋关节置换的1例患者,体外分离培养人股骨头表面关节软骨细胞,使用100 pg/ml白介素-1(Interleukin-1,IL-1)建立OA软骨细胞模型。按照单纯随机抽样法,将细胞随机分为4组:对照组、白介素1(IL-1)组、IL-1+DHA组和IL-1+DHA+3-MA组。对照组加入生理盐水; IL-1组加入100 pg/ml IL-1; IL-1+DHA组加入100 pg/ml IL-1和50μg/ml DHA; IL-1+DHA+3-MA组加入100 pg/ml IL-1和50μg/ml DHA,以及5 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)。所有细胞培养24 h后,采用Western blotting法检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、Beclin-1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和轻链3-Ⅰ/Ⅱ(LC3-Ⅰ/Ⅱ)蛋白的表达,RT-PCR法检测相关信号通路mRNA的表达(JNK、p ERK、IΚBα、PI3K、P38)。结果 与对照组相比,IL-1组中的细胞自噬活性降低。与IL-1组相比,DHA减少了m TOR通路蛋白的表达,并增加了Beclin-1和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达,差异具有统计学意义(P 0. 01),增加了细胞自噬活性。在IL-1+DHA+3-MA组,使用自噬抑制剂3-MA干预后m TOR表达增加,而Beclin-1和LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的表达减少。IL-1组的JNK、p ERK、p ERK和P38 mRNA表达量升高,差异具有统计学意义(P 0. 01);在IL-1+DHA组,使用DHA干预后JNK和P38的表达量较IL-1组下降,差异具有统计学意义(P 0. 01)。在IL-1+DHA+3-MA组,使用自噬抑制剂3-MA干预后,JNK和P38表达量明显上升,差异具有统计学意义(P 0. 01)。结论 DHA可促进OA软骨细胞的自噬活性,其作用是通过抑制JNK和P38信号通路的蛋白表达而实现的。自噬抑制剂3-MA可以阻断DHA对OA软骨细胞自噬的促进作用。     

脓毒症大鼠调节性T细胞凋亡对辅助性T细胞漂移的影响及血必净注射液的干预作用

目的 探讨脓毒症大鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)凋亡对辅助性T细胞(Th)漂移的影响及血必净注射液的干预作用.方法 将Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、血必净组,每组8只.行盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症大鼠模型.于第3日采用免疫磁珠法分选各组CD4+CD25+Treg并培养12 h,用流式细胞仪检测Treg凋亡率及叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和T淋巴细胞毒性相关抗原4(CTLA-4)的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-10(IL-10)的分泌量;再将CD4+CD25+ Treg与CD4+CD25-T细胞1∶1共培养,刀豆素A刺激68 h,ELISA检测Th1、Th2、Th17分泌的γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-17水平.结果 正常组Treg凋亡率[(12.03±0.89)%]与假手术组[(9.48±2.17)%]比较差异无统计学意义;模型组Treg凋亡率[(5.87±0.44)%]明显低于正常组和假手术组;而血必净组的Treg凋亡率[(27.29±2.48)%]显著高于其他各组(P均<0.01).Foxp3、CTLA-4表达和IL-10分泌量随Treg凋亡率增加而减少,相关系数(r)分别为-0.878(P=0.042)、-0.877(P=0.042)、-0.743(P=0.010).与正常组比较,模型组IFN-γ、IL-4水平和IFN-γ/IL-4比值均明显升高[IFN-γ:(254.70±44.88)ng/L比(0.68±0.78)ng/L,IL-4:(8.82±0.61)ng/L比(3.48±0.98)ng/L,IFN-γ/IL-4比值:30.28±4.87比0.23±0.30,P均<0.01];而血必净组IFN-γ[(491.54±84.28)ng/L]和IFN-γ/IL-4比值(45.31±8.01)均显著高于模型组(P<0.01和P<0.05);各组间IL-17水平无明显差异(P均>0.05).结论 脓毒症时Treg凋亡率增加可减轻对效应T细胞的抑制功能,血必净注射液能有效促进脓毒症Treg凋亡,介导Th2向Th1漂移.     

肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的影响

目的探讨肝细胞生长因子激活剂的抑制剂-1(hepatocyte growth factor activator inhibitor-1, HAI-1)基因对宫颈癌细胞自噬及凋亡调控的机制。方法对数生长期HeLa细胞分为转染组和对照组,转染组转染HAI-1质粒,对照组细胞正常培养。采用实时荧光定量PCR法检测2组细胞HAI-1 mRNA表达情况,采用AO染色和流式细胞术检测2组细胞自噬情况,采用ELISA检测2组细胞自噬相关因子LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平,应用流式细胞仪检测2组细胞凋亡率,采用Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2蛋白相对表达量。结果转染组细胞HAI-1 mRNA相对表达量(1.57±0.26)、AO细胞荧光强度(52.14±3.88)、LC3-Ⅱ蛋白[(3.42±0.85)μg/L]、Beclin-1蛋白[(14.69±1.96)μg/L]水平、细胞凋亡率[(86.75±6.42)%]、Bax蛋白相对表达量(1.24±0.13)和Bax/Bcl-2(7.75±0.83)高于对照组[0.48±0.09、5.47±0.32、(1.10±0.22)μg/L、(10.12±0.53)μg/L、(12.64±1.33)%、0.25±0.06、0.17±0.05)](P0.05),LC3-Ⅰ蛋白水平[(0.59±0.11)μg/L]、Bcl-2蛋白相对表达量(0.16±0.04)低于对照组[(3.26±0.82)μg/L、1.47±0.15](P0.05)。结论 HAI-1转染通过增加HeLa细胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,降低LC3-Ⅰ蛋白表达,提高Bax/Bcl-2来调节宫颈癌细胞的自噬和凋亡。     

血必净注射液对卵蛋白致敏小鼠气道MUC5AC及Th1／Th2细胞因子表达的影响

目的研究血必净注射液对卵蛋白（OVA）致敏小鼠气道MUC5AC及Th1/Th2细胞因子表达的影响,探讨干预气道黏液高分泌的机制。方法卵蛋白腹腔注射致敏小鼠,32只小鼠随机分组为：对照组、哮喘组、地塞米松治疗组和血必净治疗组,每组8只,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ的水平变化,实时RT-PCR检测小鼠肺组织MUC5AC mRNA表达变化。结果 （1）与对照组小鼠气道MUC5A mRNA表达（0.377±0.021）相比,哮喘组（1.103±0.087）明显增多（P〈0.01）;地塞米松治疗组（0.403±0.038）及血必净治疗组（0.437±0.031）小鼠气道MUC5A mRNA表达较哮喘组明显降低（P〈0.01）;（2）与对照组小鼠BALF表达IL-4[（22.812±1.978）ng/L]及IFN-γ[（101.232±9.664）ng/L]比较,哮喘组BALF表达IL-4[（87.234±6.901）ng/L]水平升高（P〈0.01）,而IFN-γ表达[（47.231±3.887）ng/L]明显降低（P〈0.01）;与哮喘组比较,地塞米松治疗组（[36.289±3.012）ng/L]及血必净治疗组IL-4水平[（38.112±2.761）ng/L]均显著降低（P〈0.01）;结论血必净注射液降低IL-4和MUC5AC的表达,提示在抑制气道黏液高分泌及控制哮喘方面具有意义。