人胎脑室下区发育过程中神经干细胞的变化

目的观察人胎脑室下区不同发育时期神经干细胞(NSCs)的变化,为调控自身NSCs治疗神经系统退行性疾病提供实验依据。方法收集胎龄24~28周的水囊引产胎儿30例,采用原位杂交及光镜技术对其脑室下区NSCs的分布、形态以及生长方式进行检测。结果不同胎龄人胎脑室下区均可见Nestin mRNA表达阳性NSCs,NSCs呈星形,有3~6个突起,多个突起形成网丛,细胞散在分布在网丛中,胞核呈圆形,1~4个核仁,细胞染色质疏松。多数NSCs单个存在,可见对称分裂的NestinmRNA表达阳性NSCs和3个NSCs形成的集落样生长方式。不同胎龄Nestin mRNA表达阳性NSCs的分布部位、细胞形态无明显区别,但Nestin mRNA表达阳性NSCs生长方式上存在一定差异。结论不同胎龄人胎脑室下区均存在NSCs,NSCs生长方式随胎龄不同而变化,调控在体NSCs有望成为治疗儿童神经退行性疾病的另一种有效方法。     

骨髓间充质干细胞在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的分化

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的存活与分化,探寻细胞替代治疗先天性脊椎裂的方法。方法用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中。母鼠孕20 d时取先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冷冻切片,免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC中巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果骨髓MSC中CD90阳性细胞占99%,CD44阳性细胞占95%,不表达CD34。腺病毒-EGFP转染骨髓MSC的转染率为61%。致畸组显性脊椎裂胎鼠占64.3%。移植的MSC存在于脊髓表面或进入脊髓中,部分细胞变为长梭形或多角形。免疫荧光法检测结果显示移植到脊髓中的MSC可表达神经干细胞的标志物Nestin和神经胶质细胞的标志物GFAP。结论带有EGFP的MSC经细胞移植后能在胎鼠脊髓内存活,并能分化为神经干细胞和神经胶质细胞。     

不同胎龄人胎脑皮质枕叶神经干细胞的发育特征

目的探讨不同胎龄胎脑皮质枕叶神经干细胞（NSCs）的发育特征。方法收集胎龄16～36周的水囊引产胎儿90例，采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑皮质枕叶NSCs的分布、形态、生长方式及数量进行检测。结果NSCs主要分布在锥体细胞层及内颗粒细胞层．呈圆形，中等大小，0、1个突起，核相对较大，2—4个核仁，染色质疏松。NSCs呈明显的区域性分布，大部分NSCs以群状、簇状或数个细胞形成的小集落样生长方式存在，少数NSCs以单个形式存在于其他神经细胞中，各胎龄组NSCs在分布、形态、种类、生长方式等方面无明显差异。随着胎龄的增加，皮质枕叶NSCs逐渐减少。结论不同胎龄人胎脑皮质枕叶存在NSCs，其数量随着胎龄的增加而减少。     

大鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养和诱导分化

目的 探索从大鼠胚胎肠组织获取肠神经嵴干细胞（neural crest stem cells，NCSCs）的可能性；与脑神经干细胞（neural stem cells，NScs）比较，了解其生物学性状。方法 用NSCs的培养液同时进行肠NCSCs和脑NSCs的培养；得到的神经细胞球用神经上皮干细胞蛋白（nestin）进行鉴定，计数NCSCs神经细胞球和NSCs神经细胞球中各自的Nestin阳性细胞比例。NCSCs神经细胞球在胎牛血清诱导分化培养7d后，用神经元细胞特异性标记神经纤维丝蛋白（NF68）和星形胶质细胞特异性标记神经胶质酸性蛋白（GFAP）对其进行免疫荧光鉴定。结果从大鼠胚胎肠组织成功得到NCSCs，并且形成神经细胞球，Nestin为阳性；分化后细胞为NF68或者GFAP阳性；与NSCs比较，NCSCs能较快形成神经细胞球，其神经细胞球中的Nestin阳性细胞比例（66．75±12．42）％低于NSCs（91．60±5．62）％（P=0．000）。结论 肠NCSCs可以从大鼠胚胎肠组织分离培养得到，在体外培养环境下能够增殖，并且具有多向分化潜能。     

人胎脑Nestin阳性神经元的发育

目的：观察人胎脑有无Nestin阳性细胞存在及其发育。方法：收集胎龄为16～32周不等的自愿终止妊娠引产的正常胚胎15例。应用HE染 色和免疫细胞化学方法观察不同胎龄的人胎脑脑室管膜下区、海马、纹状体的Nestin阳性细 胞。结果：分别在胎龄16周、17周、20+3周、22周、23周、24+ 5 周、25周和27周的胎脑上述3个部位中发现有数量不等的Nestin阳性表达细胞,且呈现两 种不同形态。结论：人胎脑的脑室管膜下区、海马、纹状体存在Nestin阳 性表达细胞,且呈两种不同形态。     

36周胎龄人胎脑不同部位神经干细胞变化特征研究

目的观察同胎龄不同部位人胎脑神经干细胞(NSCs)的变化特征。方法收集胎龄36周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位NSCs的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果36周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs,NSCs呈圆形、椭圆形、星形、多角形及梭形,以圆形及星形多见;细胞0～4个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1～2个核仁不等。可见NSCs呈群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少。结论36周胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

6种固定液对小鼠皮肤急性炎性反应冷冻组织切片免疫组织化学染色效果的比较

目的探讨不同固定液对小鼠冷冻切片免疫组织化学染色的影响,筛选出相对适合的固定液。方法选取Balb/C小鼠2只,制作皮肤炎性反应模型。小鼠麻醉后剃除背部皮肤表面的毛发,局部暴露于70℃热水中35 s,形成1处1.5 cm×1.5 cm的深Ⅱ°皮肤烫伤,第7天取材,部位为以烫伤为中心的大小2.5 cm×2.5 cm全皮层组织,包埋后冷冻连续切片。取1组切片,即刻进行免疫组织化学染色,EAF(85%丙酮+10%甲醛+5%醋酸)、AAF(85%无水乙醇+10%甲醛+5%醋酸)、甲醛钙(100%甲醛+1%氯化钙)、甲醛(10%)、丙酮(100%)、乙醇(95%)6种固定液分别染色4张,2张切片不经固定液处理;取另一组切片,先采用丙酮、乙醇分别固定4张,另有2张切片不经固定液处理,再在-20℃保存14 d后取出进行免疫组织化学染色,检测表达于巨噬细胞胞浆的F4/80和表达于细胞膜表面的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)受体。结果小鼠皮肤炎性反应模型造模成功,HE染色结果提示炎性反应。即刻染色的切片中,F4/80表达结果显示,AAF、EAF、甲醛、甲醛钙固定切片为阴性,丙酮、乙醇固定和未固定切片为阳性;TNF-α表达结果显示,AAF、EAF固定切片为阴性,甲醛、甲醛钙、丙酮、乙醇固定和未固定切片为阳性。低温保存2周后,丙酮、乙醇固定切片的TNF-α阳性表达低于即刻染色组,但F4/80表达未见明显差异。结论不同固定液对冷冻切片的免疫组织化学染色结果有影响。丙酮和乙醇固定液更适用于炎性组织冷冻切片的固定,是相对理想的固定液。     

当归对宫内缺氧后幼年大鼠齿状回神经干细胞增殖的影响

目的 探讨宫内缺氧对40日龄幼年大鼠齿状回神经干细胞(NSCs)增殖的影响及当归对NSCs的干预作用.方法 实验室配种得孕SD大鼠(39只),喂养至孕14 d,随机分为对照组(12只)、缺氧组(12只)和当归组(15只).将缺氧组大鼠置于三气培养箱内缺氧[氧体积分数为130 mL/L,温度25℃,相对湿度70%～75%,二氧化碳(CO2)体积分数为0.3～0.4 mL/L],缺氧2 h/d,连续缺氧3 d(孕第14、15、16天),制作宫内缺氧脑损伤模型,缺氧组缺氧前1 h经尾静脉注射9 S/L盐水(8 mL/kg).当归组缺氧前1 h经尾静脉注射当归注射液(8 mL/kg),其余干预方法同缺氧组.对照组经尾静脉注射9 g/L盐水,不缺氧.自然生产,喂养新生大鼠至产后第40天,每组随机取幼年大鼠腩组织:对照组12只、缺氧组12只、当归组15只;常规石蜡切片后,行巢蛋白(Nestin)免疫组织化学染色,在显微镜(×200)下观察Nestin阳性物质的表达,组间比较采用单因素方差分析.结果 缺氧组Nestin阳性染色面积比对照组大,差异有统计学意义(P<0.05),当归组Nestin阳性染色面积比缺氧组小,差异有统计学意义(P<0.05),当归组面积较对照组增大,但差异无显著意义(P>0.05);3组平均吸光度、积分吸光度两两比较,差异均无显著意义.结论 氧体积分数130 mL/L的缺氧环境促进了幼年大鼠齿状回NSCs的增殖,当归注射液可减轻宫内缺氧后幼年大鼠NSCs的增殖反应.     

不同胎龄人胎脑室下区神经干细胞生长特征及增殖分化实验研究

目的 探讨不同胎龄人胎脑室下区神经干细胞（NSCs）的生长特征。方法 收集胎龄16～36周的胎儿90例,每例研究对象取室下区脑组织作为实验材料。所有研究对象产前经B超诊断患有先天性心脏病或消化道畸形,均无脑发育异常,孕妇及其丈夫要求终止妊娠。采用免疫组化技术对人胎脑室下区NSCs的形态、存在方式以及数量进行检测,采用细胞培养技术对其进行培养、传代、分化观察,并应用免疫组化技术对培养及分化的细胞进行鉴定。结果人胎脑室下区NSCs具有星形、圆形、椭圆形及梭形等形态,以星形最多。细胞胞浆相对较少;核呈圆形,染色质疏松,1-4个核仁不等。可见NSCs对称分裂和不对称分裂现象,NSCs多数单个散在分布,有的NSCs与别的NSCs形成突触联系。不同胎龄人胎脑室下区NSCs随着胎龄的增加而减少（x^2=4644．602,P〈0．01）。不同胎龄以及同一胎龄不同个体的NSCs在上述方面存在一定的差别。从人胎脑室下区分离的细胞在无血清培养时呈悬浮状态生长,形成神经球。该细胞可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;而在含血清培养时能分化,分化细胞表达神经元细胞、少突及星形胶质细胞的特异性抗原。结论 不同胎龄人胎脑室下区均存在NSCs,且在形态、存在方式及数量上存在一定的差异。不同胎龄人胎脑室下区均能在体外培养出NSCs。     

32周胎龄人胎脑神经干细胞发育状态的研究

目的探讨人同一胎龄胎脑不同部位神经干细胞的发育状态。方法收集胎龄32周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位的神经干细胞(NSCs)的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果32周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs。NSCs呈圆形、椭圆形及星形,以圆形及星形多见;细胞有0~2个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1~2个核仁不等。NSCs呈明显的区域性分布,可见群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式,有的NSCs与其他NSCs形成突触联系。不同部位上述特点有所不同。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少,检出率差异非常显著。结论人胎脑的海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等部位均存在NSCs;且同一胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

人胎脑海马部位神经干细胞形态学观察

目的 探讨人胎脑海马部位神经干细胞的形态学发育特点。方法 收集胎龄20～36周的自愿水囊引产胎儿75例，采用免疫组织化学和光镜观察技术对胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式进行检测。结果 神经干细胞主要分布于海马多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层，分子层也可见，细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形，以圆形细胞多见，0～2个突起不等，以1个突起多见。细胞胞浆丰富；核呈圆形及椭圆形，染色质疏松，2～5个核仁不等。多数单个散在分布，可见对称分裂现象，有的干细胞呈簇状分布，有的干细胞突起与别的细胞保持联系。结论 人胎脑海马部位各层均存在神经干细胞，海马可能存在齿状回之外的神经干细胞生发中心。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

脑源性神经营养因子及神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的实验研究

目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)及神经干细胞(NSCs)联合移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗效果.方法 取新生24 h的Wistar大鼠海马NSCs进行培养、鉴定.选7日龄Wistar大鼠制备HIBD动物模型,模型制备后7 d行损伤侧侧脑室移植.将实验大鼠随机分为6组:正常组、模型组、假移植组、NSCs移植组、BDNF组、BDNF+NSCs移植组(联合移植组).移植后4周进行功能实验,取脑组织进行免疫组化免疫荧光检测.结果 从新生大鼠海马可成功培养出NSCs.Y迷宫实验结果:NSCs移植组达到学会的次数及正确记忆次数(163±11.60,5.00±1.13)n;BDNF组(150.00±8.94,5.17±1.47)n;BDNF+NSCs移植组(111.25±13.56,6.23±1.60)n.悬吊实验结果:NSCs移植组平均(30.10±11.8)s;BDNF组(36.25±10.98)s;BDNF+NSCs移植组(43.6±10.56)s.斜坡试验结果:NSCs移植组(20.3±8.25)s;BDNF组(14.33±2.88)s;BDNF+NSCs移植组(11.17±2.48)s.表明联合移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与NSCs移植组比较明显改善(P＜0.05),而NSCs移植组大鼠学习记忆能力及神经功能与HIBD组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).联合移植组损伤侧额叶皮层、海马存活的NSCs数量(9.31±0.71个,10.10±1.65个)与NSCs移植组(3.33±0.24个,4.22±0.33个)比较差异具有统计学意义(P＜0.01),且NSCs分化为神经元的比例明显增多,与NSCs移植组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BDNF与NSCs联合移植较单独NSCs移植对HIBD有更好的疗效.     

Neural stem cells: properties and therapeutic potentials for hypoxic‐ischemic brain injury in newborn infants

Neural stem cells (NSCs) are defined by their ability to self‐renew, to differentiate into cells of all glial and neuronal lineages throughout the neuraxis, and to populate developing or degenerating central nervous system (CNS) regions. The recognition that NSCs propagated in culture could be reimplanted into the mammalian brain, where they might integrate appropriately throughout the mammalian CNS and stably express foreign genes, has unveiled a new role for neural transplantation and gene therapy and a possible strategy for addressing the CNS manifestations of diseases that hitherto had been refractory to intervention. An intriguing phenomenon with possible therapeutic potentials has begun to emerge from our observations of the behavior of NSCs in animal models of neonatal hypoxic‐ischemic (HI) brain injury. During phases of active neurodegeneration, factors seem to be transiently elaborated to which NSCs may respond by migrating to degenerating regions and differentiating specifically towards replacement of dying neural cells. NSCs may attempt to repopulate and reconstitute ablated regions. These ‘repair mechanisms’ may actually reflect the reexpression of basic developmental principles that may be harnessed for therapeutic ends. In addition, NSCs may serve as vehicles for gene delivery and appear capable of simultaneous neural cell replacement and gene therapy (e.g. with factors that might enhance neuronal differentiation, neurites outgrowth, proper connectivity, and/or neuroprotection). When combined with certain synthetic biomaterials, NSCs may be even more effective in ‘engineering’ the damaged CNS towards reconstitution. We have also cultured human NSCs or progenitors as neurospheres which were derived from fetal cadavers at 13 weeks of gestation, and transplanted them into HI‐injured immature brains to investigate their therapeutic potentials in this type of model.     

人胰岛素样生长因子1基因质粒载体的构建及其在人脐血源性神经干细胞中的表达

目的 构建人胰岛素样生长因子1(IGF-1)质粒表达载体,并观察重组体pcDNA3.1-IGF-1转染后的脐血源性神经干细胞(NSCs)中IGF-1基因的表达情况.方法 通过反转录-PCR(RT-PCR)方法从胎肝中提取IGF-1基因,胶回收方法分别纯化PCR产物(IGF-1基因)和质粒pcDNA3.1,二者分别由DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切后,经T4 DNA Ligase连接的方法将IGF-1基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1中,采用测序方法及DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-IGF-1及空质粒pcDNA3.1分别转染至脐血源性NSCs内,经G418抗性筛选后,利用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测IGF-1基因在基因转染脐血源性NSCs内的表达情况.结果 IGF-1基因从胎肝中成功提取.重组体pcDNA3.1-IGF-1经基因测序及DNA限制性内切酶BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1构建正确.重组体经脂质体法转染脐血源性NSCs 24 h后,经G418筛选2周得到细胞抗性克隆,免疫细胞化学法检测到IGF-1基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中成功表达.RT-PCR方法检测到重组质粒pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中IGF-1 mRNA表达阳性,而空质粒pcDNA3.1转染的脐血源性NSCs中IGF-1 mRNA表达阴性.结论 IGF-1基因可在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs内成功表达.