CM-Dil体外标记人脐带间充质干细胞传代示踪的可行性

背景: 掌握人脐带间充质干细胞的移植示踪方法是研究其生物学特性的关键.目的: 观察用CM-Dil标记人脐带间充质干细胞及在体外传代示踪的可行性.方法: 采用酶消化法体外分离培养人脐带间充质干细胞,通过流式细胞仪检测细胞免疫表型和细胞周期、体外成脂成骨诱导鉴定该细胞.将第5代细胞用CM-Dil标记,并将细胞传代,荧光显微镜观察体外标记情况.结果与结论: 第3代人脐带间充质干细胞强表达CD44,CD29,低表达CD106,不表达CD34、CD40;有80%以上的细胞处在G0/G1期,成脂成骨诱导后,油红O染色和碱性磷酸酶染色分别阳性.CM-Dil标记人脐带间充质干细胞细胞标记率达90%以上,体外传代后荧光强度逐渐减退,传8代后,荧光基本消失.说明人脐带间充质干细胞增殖、分化能力强,CM-Dil标记细胞示踪方法简单易行.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景:骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104～1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求.目的:观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成.材料:清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%～90%胰蛋白酶消化传代.取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力.结果:原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力.第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CDl06均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性.成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成.成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴. 结论:全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.     

C57小鼠脂肪及骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

背景：研究发现,脂肪源干细胞具有和骨髓间充质干细胞一样的贴壁和形成成纤维样克隆特性,并具有向骨、脂肪、软骨等多系分化的能力。 目的：比较C57小鼠脂肪源间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学特点。 方法：在无菌的条件下分别从C57小鼠的脂肪和骨髓中获取脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。体外分离、培养并将脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞传至第3代,进行细胞形态、表面标记、生长动力学分化潜能测定和Notch信号相关基因的检测。 结果与结论：脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞形态学相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD29、CD105、Sca-1,不表达CD34、CD133,但骨髓间充质干细胞还表达CD45;生长曲线和细胞克隆分析显示脂肪间充质干细胞的增殖速度明显比骨髓间充质干细胞快;脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均可向成骨、成脂、成软骨诱导分化,脂肪间充质干细胞更易向成骨诱导;Notch 相关基因检测显示脂肪源干细胞的 Jagged-1表达水平明显比骨髓间充质干细胞低,而 Hes-1的表达水平脂肪源干细胞明显高于骨髓间充质干细胞的表达水平。提示脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞扩增能力更强,更易向成骨分化,可能与Hes-1表达水平有关。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景:自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的:观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论:分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P<0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子和CM-DiI荧光双标记骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植疗效监测取决于有效的标记方法,从而能够对移植细胞进行示踪.超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide,SPIO)是一种较为理想的新型磁共振对比剂,用SPIO标记细胞可实现对移植细胞进行活体示踪.而荧光活性染料CM-Dil无细胞毒性,不影响细胞的生长,适合标记和示踪细胞.目的:观察SPIO及CM-Dil对骨髓间充质干细胞的标记及示踪效果.方法:全骨髓法培养猪骨髓间充质干细胞,用含50 mg/L铁浓度的SPIO及CM-Dil标记骨髓间充质干细胞,将双标后的骨髓间充质干细胞经冠状动脉注入猪心肌梗死模型.4周后取心脏组织行冰冻切片观察.结果与结论:SPIO及CM-Dil在体外标记骨髓间充质干细胞效率高,几乎达100%.经冠状动脉移植4周后心肌组织可找到双标记的骨髓间充质干细胞,结果提示SPIO及CM-Dil双标记骨髓间充质干细胞体内示踪效果好.     

BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景:目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性.目的:以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成.材料:4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供.方法:密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增.取5×1010L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎生血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导.取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率.结果:分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代争明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍末见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%.结论:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BndU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法.     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞基本生物学特征的比较

目的:分离大鼠脂肪和骨髓来源的间充质干细胞,比较两种间充质干细胞的生物学特征。方法:实验于2003-09/2006-11在广州市第一人民医院、湘雅医院中心实验室完成。取SD大鼠的股骨、胫骨、肱骨及腹股沟处脂肪垫进行骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的分离。将骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在含10%血清,1%双抗的低糖DMEM培养基,37℃、体积分数为0.05的CO2条件下进行培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用0.25%胰酶消化传代。传代至第3代使用倒置显微镜观察骨髓和脂肪两种不同来源细胞的传代后的形态、贴壁、生长增殖、集落等情况。取消化传3代的两种细胞分别制成单细胞悬液进行细胞贴壁率的检测,贴壁率=贴壁细胞总数/接种细胞总数×100%。取第2代和第5代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞以1×107L-1密度培养。每天同一时间,随机抽取5孔细胞,加入5%噻唑兰20μL/孔,培养4～6h,吸出孔内液体,每孔加150μL二甲基亚砜震荡10min,酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度,取5孔吸光度的均值,以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44标记,免疫化学检测细胞CD29、CD34、CD44。结果:①在单位质量骨髓和脂肪组织中获得的间充质干细胞数量相当。两种细胞形态均为条索样,呈成纤维细胞形态。②应用直线相关分析,考察骨髓贴壁率与脂肪贴壁率之间的关系,相关系数r=0.999,决定系数r2=0.997(F=5862.949,P<0.001),两贴壁率之间有直线相关关系,不同的时间点两种细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势。③脂肪间充质干细胞的增殖能力与骨髓间充质干细胞相当。④脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞表面表达CD29、CD44,不表达CD34。结论:自大鼠脂肪中可提取出与骨髓间充质干细胞生物学特征类似的脂肪间充质干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞表面抗原检测及其变化特点

目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系。方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成。取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1000r/min,离心10min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞。细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10mL培养液,使最终细胞密度为10个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况。待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代。将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率。结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势。②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性。结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达。随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高。普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充质干细胞CD14阴性符合率差,前者的CD44阳性表达率也较后者低。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

背景:人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞.目的:比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异.方法:采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代.分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d.结果与结论:胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小.两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106.二者均可分化为脂肪细胞.可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景.     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞（P〈0.01）。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

不同种系鼠源骨髓间质干细胞的分离培养及成脂能力

背景：目前常用骨髓间质干细胞为鼠源细胞,然而就大鼠和小鼠来源骨髓间质干细胞在传代过程中的纯化程度,表面抗原的表达和分化能力的差异性仍少见报道。目的：分离、鉴定并纯化不同种系鼠源骨髓间质干细胞,比较其在成脂分化中的差异。方法：采用差速贴壁法分离SD大鼠及Balb/c小鼠骨髓间质干细胞,通过传代纯化,并观察骨髓间质干细胞在此过程中得纯化程度及增殖状况,流式细胞数鉴别两种骨髓间质干细胞表面抗原的表达,比较不同来源间质干细胞在成脂分化的差异。结果与结论：在SD大鼠骨髓间质干细胞分离和培养过程中,其增殖能力显著强于Balb/c小鼠骨髓间质干细胞（P〈0.05）。其半数增长期为36h,在第3代时即可见典型的漩涡状贴壁生长特性。经流式细胞检测,Balb/c小鼠及SD大鼠均为不表达造血干细胞标志CD34,再后续的各代检测中亦未见该细胞标志表达（〈5%）,CD29随着不断的传代纯化其表达数量不断的增加,其中SD大鼠在第3代时其表面标志的纯度及达到99%,但Balb/c小鼠各代CD29随着纯化上升程度并不甚明显,与该种细胞镜下存在大量类内皮细胞表现相符合。在成脂方面SD大鼠骨髓间质干细胞依旧表现出了较强的多能特新,出现脂滴的时间明显早于Balb/c小鼠,随传代次数的增加,两种原代细胞均出现了自发的成脂分化的现象,且SD大鼠的出现程度大于Balb/c小鼠。说明SD大鼠来源骨髓间质干细胞较易获得纯度较高且增殖旺盛的细胞源,在成脂方面的能力强于Balb/c小鼠。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离免骨髓间充质干细胞

背景:特定条件下,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞、成软骨细胞等细胞分化.但骨髓中间充质干细胞含量极低,体外如何获取、纯化并使其高效快速增殖是组织工程技术应用和推广的前提.目的:优化获取兔骨髓间充质干细胞并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学性状进行观察.设计、时间和地点:观察性实验,于2005-09/2006-07在同济医学院实验动物中心完成.材料:兔龄2个月雌性新西兰纯种大耳白兔1只,用于间充质干细胞取材及原代培养.方法:采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对抽取的骨髓液进行纯化.首先将培养瓶中的培养液吸出,加PBS后再加入2.5 g/L胰酶约3.0 mL,置于37℃培养箱中,两三分钟后在倒置显微镜下观察细胞形态,当细胞胞质回缩,细胞变瘦长,细胞间隙增大,同时有少量脱肇的圆形细胞时可终止消化,加入含血清的L-DMEM完全培养基即可.按1.0X 108L-1的密度接种到一次性塑料培养瓶中进行培养.主要观察指标:间充质干细胞的形态、超微结构和表面标志物的表达;第1,3,5,8,10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.结果:①经密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代方法所得的间充质干细胞很纯,第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构.②透射电镜观察显示间充质干细胞核大,以圆形或类圆形为主,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞.③传代培养的间充质干细胞生长曲线呈S型,第1,3,5代细胞增殖能力强,细胞生长旺盛,而第8,10代细胞增殖明显减弱.④所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34,电镜观察为低分化细胞.结论:分离培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,第3代和第5代细胞很纯且其增殖能力强.     

氯甲基苯甲酰胺标记大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的可行性

背景:氯甲基苯甲酰胺被认为是目前较为稳定的细胞荧光标记物质。目的:观察荧光染料氯甲基苯甲酰胺标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞的标记效果及其对细胞形态、生长及增殖能力等生物学特性的影响。方法:采用胶原酶消化法分离、培养SD大鼠肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,以氯甲基苯甲酰胺细胞标记液标记第3代肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞。结果与结论:荧光显微镜下观察氯甲基苯甲酰胺标记的肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞呈红色荧光,细胞标记率达95%以上,标记前后细胞形态、生长及增殖等方面无明显变化。经多次传代培养后,红色荧光细胞数量及强度有所下降,但细胞传代至第8代,氯甲基苯甲酰胺标记后的第15天细胞标记率仍可达50%以上。表明氯甲基苯甲酰胺可有效标记肾脂肪囊来源脂肪间充质干细胞,且方法简单,标记率高,对细胞无毒性,不影响细胞生物学特性。     

荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖及其成骨分化

背景：目前关于骨髓基质干细胞的标记报道较多,各有其优缺点,寻找一种有效、简便的细胞标记与示踪的方法尤为关键。目的：观察经荧光活性染料DiI标记的大鼠骨髓基质干细胞生长增殖与成骨分化情况。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-09/12在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料：SD大鼠10只,由南方医科大学实验动物中心提供。DiI应用液为美国Molecular ProbeInc公司产品。方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,再加入1×109L-1的DiI应用液5μL,37℃下孵育25min,清洗离心后,加入DMEM高糖完全培养基,荧光显微镜观察细胞荧光强度及形态变化。另取传至第3代细胞,加入含地塞米松、维生素C、β-磷酸甘钠、体积分数为10%胎牛血清的成骨诱导剂进行诱导分化。主要观察指标：DiI标记后细胞形态变化,XTT比色法测定细胞增殖状况,细胞上清液中乳酸脱氢酶活性,成骨诱导后细胞碱性磷酸酶活性及成骨分化能力。结果：锥虫蓝染色见骨髓基质干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下DiI标记后全部细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与未标记细胞比较,DiI标记的骨髓基质干细胞增殖吸光度、培养上清液乳酸脱氢酶活性、碱性磷酸酶活性均无明显变化（P〉0.05）。成骨诱导7d后,钙钴法染色两组骨髓基质干细胞均见不同程度的胞质呈棕黑色改变。结论：DiI能有效标记体外培养的骨髓基质干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性作用;此外,DiI标记不影响骨髓基质干细胞的生长、增殖及成骨分化能力。     

全骨髓直接贴壁分离人骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:体外分离培养骨髓间充质干细胞成为实验研究和临床应用的关键环节。目的:采用全骨髓培养法分离人骨髓间充质干细胞,建立一种简单、有效的分离培养骨髓间充质干细胞的方法。方法:通过全骨髓培养法分离培养人骨髓间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养。分别在特定诱导体系中诱导人骨髓间充质干细胞向脂肪、成骨及软骨细胞分化。结果与结论:采用全骨髓培养分离法能获得90%以上纯度的骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD73、CD90、CD105,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h;细胞周期分析表明:G0~G1期和S+G2+M期所占比例分别为71.63%和28.37%;诱导分化结果显示,人骨髓间充质干细胞能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。说明全骨髓分离培养法是一种较好的分离人骨髓间充质干细胞的方法。     

人骨髓间充质干细胞体外扩增的生物学评估

本研究旨在对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）进行移植前增殖分化能力测定，病毒学检查，核型分析，PCR-STR和甩A的检测，以便为临床应用提供安全、可靠的移植细胞。采用贴壁法分离骨髓MSC，在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、成骨、成脂分化能力的变化情况，并进行不同生长时期的核型分析，利用札A—SBT技术检测4个不同供者来源的MSC的HLA-I和HLA—II位点的高分辨分型；应用PCR—STR技术检测4个不同供者来源的MSC基因遗传标记。并且利用ELISA方法检测HIV，HBV，HCV和TP，使用PCR方法检测支原体污染。结果表明：随着传代次数增加，MSC的增殖能力、成骨能力均有所下降。在扩增过程中，MSC始终保持较高的纯度，CD29、CD44、CD105、CD166、CD73均表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80和CD86均表达阴性。在8代以前未发现核型变异。4个不同供者来源的MSC的札A高分辨分型和STR基因分型结果为MSC3的TP表达阳性，MSC2在5代出现支原体污染。结论：在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失，其中向成骨方向的分化潜能降低。MSC在8代以前可作为实验研究及临床应用的良好对象。     

CM-DiI标记大鼠脂肪干细胞的效力

背景:CM-DiI是DiI的衍生物,因具有一定的水溶性,且含有氯甲基化活性巯基部分,使其更易嵌入、弥散并稳固地结合到整个细胞膜上,使染色更快捷、均匀、持久。目的:进一步验证荧光染料CM-DiI标记大鼠脂肪干细胞的可行性。方法:切取大鼠腹股沟区皮下脂肪组织,采用胶原酶消化法体外分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分为实验组和对照组,用质量浓度4mg/L的CM-DiI对实验组细胞进行标记,于6,12,24,48h观察CM-DiI标记脂肪干细胞体内示踪效果。结果与结论:荧光显微镜下CM-DiI标记细胞的胞浆、胞膜均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,保持了良好的正常形态,CM-DiI标记阳性率为100%,标记早期细胞形态呈荧光环状,48h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。与对照组比较,CM-DiI标记的细胞增殖后形态、上清液乳酸脱氢酶含量及MTT值均无明显变化(P>0.05)。细胞移植后4h后,在心、肺组织可见到发出红色荧光的标记细胞。提示CM-DiI能有效标记体外培养的脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达,且标记细胞形态良好,对活体细胞无毒性。体内移植后,有良好的示踪效果。     

人骨髓基质细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和对NOD/SCID小鼠的植入

目的 研究人骨髓基质细胞(MSC)促进脐血CD34+细胞体外扩增及植入能力的作用.方法 分离、培养正常人的MSC作为滋养层细胞.在TPO、SCF、FL和G-CSF刺激下,比较有、无MSC滋养层细胞对扩增脐血CD34+细胞后,CD34+细胞和CFU数的增加倍数,以及植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的能力.结果 以骨髓MSC为滋养层细胞的培养体系可以更加有效地扩增脐血CD34+细胞.体外扩增1周总细胞数(TNC)、CD34+细胞和CFU的均数分别增加111.6、19.3和58.0倍;体外扩增2周后TNC、CD34+细胞和CFU的均数分别增加532.8、41.3和563.5倍.脐血细胞输入NOD/SCID小鼠6周后,移植未扩增脐血细胞的对照组小鼠骨髓细胞中人CD45+细胞比例仅为1.2%～3.7%;移植单纯细胞因子刺激扩增组小鼠骨髓中,人CD45+细胞比例为7.6%～12.1%;以MSC为滋养层扩增的脐血细胞移植组,人CD45+细胞比例达到45.3%～59.1%.结论 以人骨髓MSC为作为饲养层细胞,不但可以更加有效扩增脐血CD34+细胞,而且可以促进脐血细胞植入NOD/SCID小鼠的能力,有潜在的临床应用价值.