人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

pEGFP-N1-Fcy::Fur重组质粒的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达

目的:构建携带木薯亚麻苦甙水解酶(lis)基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导人人肝癌细胞MHCCW中表达.方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体.利用电穿孔转染体外培养的MHCC97,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测lis基因转录水平的表达;Western Blot方法验证lis蛋白水平的表达.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,酶切和测序证明pEGFP-N1-lis真核表达载体构建成功.pEGFP-N1-lis转染MHCC97细胞后,Western Blot可以检测到lis蛋白在MHCC97细胞表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-lis,可为后续lis基因功能的研究奠定实验基础.     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.     

针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染

目的 以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响.方法 构建pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体.应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态.结果 成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象.结论 成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞.     

带GFP的启动子鉴定质粒的构建及在HCV启动子鉴定中的应用

目的:利用已有质粒构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并用此质粒鉴定丙型肝炎病毒5非翻译区(HCV5'-UTR)启动基因表达的活性.方法:用限制性内切酶将质粒pEGFP-N1上的EGFP基因片断切下,与用相同酶切去除荧光素酶基因片断的PGL3 enhancer质粒大片断连接,得到带GFP的启动子鉴定质粒pEGFP enhancer.HCV 5'-UTR片断用PCR方法获得,插入pEGFP enhancer的多克隆区,构建HCV 5'-UTR驱动GFP表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光.结果:成功构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并在此基础上构建了HCV 5'-UTR启动GFP表达的质粒.前者转染HepG2细胞后,几乎无GFP表达,而后者观察到较强的绿色荧光.结论:该实验构建的带GFP报告基因的启动子鉴定质粒本底表达低,可用于真核启动子的鉴定.HCV 5'-UTR可以启动报告基因的表达,具有启动子活性.     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。     

ephrinB2真核表达载体的构建及其在Hela细胞的表达

目的构建ephrinB2重组真核表达载体,研究该质粒在细胞中的表达,为研究ephrinB2对肿瘤生长及血管生成的影响奠定基础。方法逆转录获得人ephrinB2全长cDNA序列,连接到pEGFPN1上,转化大肠杆菌,脂质体转染Hela细胞。RT-PCR检测转录情况,WB鉴定目的蛋白表达。结果酶切和测序证实正确构建重组质粒,并在Hela细胞中表达。结论成功构建了pEGFPN1-ephrinB2真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究ephrinB2的功能奠定基础。     

博尔纳病病毒p40基因重组质粒的构建及鉴定

目的 构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.方法 通过PCR方法扩增获得博尔纳病病毒p40基因的完整序列,将此片段定向克隆到pEGFP-N1载体多克隆位点区,筛选重组阳性菌株,提取重组质粒,利用PCR方法和核酸序列测定验证重组质粒构建的正确性.结果 成功构建博尔纳病病毒p40基因重组表达质粒.结论 本文构建的重组质粒将为研究博尔纳病病毒p40基因在真核细胞中的功能和作用提供实验依据.     

重组小鼠白介素-2基因在真核细胞中的转染表达

目的：在构建重组真核表达载体pIRESneo2／mIL-2的基础上,建立能够持续稳定表达mIL-2的哺乳类工程细胞。方法：运用分子克隆技术,将由RT-PCR获得的mIL-2cDNA片断插入真核表达质粒pIRESneo2构建成mIL-2重组表达载体pIRESneo2／mIL-2。通过脂质体转染法将pIRESneo2／mIL-2导入C2C12细胞。转染后第30天,用Western blots检测mIL-2表达情况。结果：经DNA测序证明mIL-2cDNA片断插入方向和碱基组成顺序均准确无误,Western blots检测转染真核重组表达载体pIRESneo2／mIL-2的C2C12细胞系表达mIL-2。结论：利用pIRESneo2／mIL-2构建的真核表达载体在C2C12细胞系中能够持续稳定表达mIL-2。     

分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定

目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.     

EBNA2基因真核表达载体的构建及表达产物的功能

目的: 构建EB病毒核心抗原2(EBNA2)的真核表达载体,在真核细胞中表达,并检测其表达产物的功能.方法: 应用DNA重组和PCR方法从质粒pSG5-EBNA2中亚克隆EBNA2的编码基因,插入到真核表达载体pCMV-HA中.应用脂质体的方法将重组质粒pCMV-EBNA2瞬时转染Cos-7细胞,通过Western blot和免疫荧光方法检测EBNA2的表达.应用荧光素酶报告实验检测EBNA2蛋白的活性.结果:克隆EBNA2的编码基因,经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致.以含有EBNA2编码基因的真核表达载体瞬时转染Cos-7细胞,EBNA2基因的表达产物通过Western blot和免疫荧光方法得到证实.荧光素酶报告实验显示所表达的蛋白具有转录激活活性.结论:成功构建EBNA2的真核表达载体,证实其在真核细胞Cos-7可以表达,并具有转录激活功能.     

远红荧光蛋白报告基因mKate2对肝癌细胞的标记及荧光成像

目的 制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法 以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKate2表达质粒和包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并测定慢病毒的活性滴度;mKate2慢病毒以病毒感染复数(MOI)=6感染HepG2 96 h后,通过荧光显微镜观察和流式细胞分析法(FACS)检测感染效率;收集2×106个mKate2-HepG2细胞,通过光学成像系统进行荧光成像,确定最佳成像参数.结果 测序结果显示,mKate2基因序列正确,无突变或缺失;mKate2慢病毒的活性滴度为1.6×106TU/ml;mKate2慢病毒感染HepG2 96 h后,荧光显微镜下观察到大量红色荧光蛋白的表达,FACS检测显示mKate2的阳性率为93.8%±0.4%;激发光(530±15)nm和发射光(710±28)am为对mKate2-HepG2细胞进行荧光成像的最佳参数.结论 慢病毒能够介导远红荧光蛋白报告基因mKate2对人肝癌细胞株HepG2的高效标记,并且mKate2标记的HepG2能够进行体外细胞荧光成像,可以用于下一步的活体肿瘤示踪研究.

Abstract：

Objeclive To create far-red fluorescence protein reporter gene mKate2 lentivirus.label human liver cancer cell line HepG2 with lentivirus and explore the feasibility of in vitro fluorescence imaging of labeled tumor cells so as to provide experimental rationales for in vivo fluorescence tumor imaging.Methods mKate2 gene was amplified from pmKate2-N plasmid.Then the fragment was inserted into the lentivirus expression vector pLenti6.3/V5-DEST.The expression plasmids pLenti6.3-mKate2 and the packaging plasmids were cotransfected into 293T cells.The biological titer of lentivirus was determined.HepG2 cells were infected with mKate2 lentivirus at a MOI(virus multiplicitv of infeetion)of 6 for 96 hours.The infection efficiency was assayed through fluorescence microscope and fluorescent-activated cell scanning(FACS).And 2×106 mKate2-HepG2 cells were collected for fluorescence imaging through an optical imaging system.And the optimal imaging parameters were determined.Results DNA sequencing analysis confirmed that mKate2 gene sequence was correct and there was no mutation or deletion.The biological titer of produced mKate2 lentivims was 1.6×106 TU/ml.At 96 hours after mKate2 lentivirus infection,fluorescence microscope showed that mKate2 was expressed in a large percentage of cells.FACS assay showed that the mKate2 positive rate was 93.8%±0.4%.Excitation light 530±15 nm and emission light 710±28 nm were the optimal imaging parameters for mKate2-HepG2 cells.Conclusion Lentivirus can mediate efficiently the mKate2 reporter gene labeling of human liver cancer cell line HepG2.The mKate2-labeled HepG2 cells can be detected through in vitro fluorescence imaging.Further tracing studies of in vivo tumor fluorescence imaging age technically feasible.     

表达UGT1A1重组腺相关病毒载体的构建

目的 获得表达胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT1A1）基因；构建UGT1A1重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因，最终连接于pAAV—MCS．双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。并在HEK293T细胞表达，制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了人类UGT1A1基因．构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体。并成功表达于HEK293T细胞。结论 本实验构建的人类UGT1A1重组腺相关病毒将为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。