基于NF-κB信号通路的细柱五加中impressic acid的抗炎作用研究

目的 研究细柱五加Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith中impressic acid（IA）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的抗炎作用。方法 以LPS诱导RAW264.7细胞建立炎症模型;使用EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒检测IA对RAW264.7细胞的毒性作用;Griess法测定一氧化氮（NO）水平;ELISA法测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）水平;RT-PCR法检测TNF-α、IL-1β mRNA表达;Western blotting检测高迁移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白表达;ELISA法细胞质和细胞核的核因子-κB（NF-κB）水平。结果 Impressic acid可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β水平和HMGB1蛋白表达,并抑制NF-κB从细胞质向细胞核的转移（P<0.05、0.01）。结论 细柱五加中IA对LPS诱导的RAW264.7细胞具有抗炎作用。     

竹节参醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用

目的： 观察竹节参醇提物对脂多糖（LPS）刺激小鼠单核巨噬白血病细胞RAW264.7细胞炎症保护作用的初步 探讨。 方法： 用不同质量浓度的竹节参醇提物处理RAW264.7细胞,噻唑蓝（MTT）法检测细胞活性;检测LPS刺激的RAW264.7细胞一氧化氮（NO）释放量以及竹节参醇提物干预后RAW264.7细胞NO释放量;酶联免疫吸附（ELISA）法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、 白介素1β（IL-1β）分泌;聚合酶链反应（PCR）法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达;免疫印迹（Western blot）法检测胞浆胞核核转录因子-κB（NF-κB）蛋白表达。 结果： 竹节参醇提物作用RAW264.7细胞的安全范围<100 mg·L^-1;LPS的用药质量浓度为1 mg·L^-1;与LPS模型组相比,竹节参醇提物0.1,1,10,40 mg·L^-1能有效抑制NO释放（抑制率分别为31.2%,41%,46.1%,55.2%）和抑制TNF-α,IL-1β的分泌（P<0.05或P<0.01）;竹节参醇提物10,40 mg·L^-1能下调LPS模型组iNOS mRNA表达且抑制NF-κB的核移位。 结论： 竹节参醇提物对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有保护作用,其保护机制可能与调控NF-κB通路,进而抑制NO的释放,降低TNF-α,IL-1β,iNOS表达有关。     

基于PI3K/Akt信号通路探讨小金丹对巨噬细胞极化的调控作用及机制

目的 探讨小金丹提取物（XJD）对巨噬细胞极化的调控作用及作用机制。方法 以脂多糖（LPS）、白细胞介素-4（IL-4）刺激RAW264.7细胞诱导M1型和M2型极化。采用细胞增殖活性检测（CCK-8）法检测10~80 mg·L^-1对RAW264.7细胞增殖活性的影响;采用Griess法检测一氧化氮（NO）的释放;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞因子白细胞介素-6（IL-6）释放;采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测M1型和M2型巨噬细胞标志物的mRNA表达;采用流式细胞分析法检测CD206表达;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路关键蛋白的活化。结果 10~80 mg·L^-1 XJD对0.5 mg·L^-1 LPS和20 μg·L^-1 IL-4诱导的RAW264.7细胞增殖未见明显影响。与空白组比较,LPS诱导组M1型巨噬细胞标志物表达升高,主要包括显著增加NO、IL-6释放（P<0.01）,明显上调M1型基因白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮合酶（iNOS）、前列腺素氧化环化酶-2（COX-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA表达（P<0.01）。同LPS诱导组比较,20~80 mg·L^-1 XJD能浓度依赖性显著抑制NO、IL-6的释放（P<0.01）;10~80 mg·L^-1 XJD能浓度依赖性下调M1型基因IL-1β、iNOS、COX-2和TNF-α mRNA表达（P<0.01）。与空白组比较,IL-4诱导组M2型巨噬细胞标志物表达升高,主要包括CD206⁺巨噬细胞比例显著升高（P<0.01）,显著上调M2型基因精氨酸-1（Arg-1）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-13（IL-13）和转化生长因子-β₁（TGF-β₁）mRNA表达（P<0.01）。同IL-4诱导组比较,10~80 mg·L^-1 XJD能浓度依赖性显著降低CD206⁺ M2型巨噬细胞比例（P<0.01）;显著下调Arg-1、IL-10、IL-13和TGF-β₁ mRNA表达（P<0.01）。Western blot结果显示,与空白组比较,LPS和IL-4诱导组磷脂酰肌醇3-激酶p110（PI3K-p110）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表达均显著上调（P<0.01）;同LPS或IL-4诱导组比较,XJD能明显降低PI3K p110蛋白表达和p-Akt水平（P<0.05,P<0.01）。结论 小金丹提取物能抑制LPS和IL-4诱导RAW264.7细胞的M1型极化和M2型极化,机制与降低PI3K/Akt通路的活化水平有关。     

褐藻素诱导肝癌HepG2细胞凋亡和自噬的机制

目的：通过c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）信号通路来研究蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物的抗炎作用机制。方法：采用噻唑蓝比色法（MTT法）测定倍比稀释的蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物（浓度区间为0~640 mg·L^-1）作用于密度为5×10⁴个/mL的RAW264.7细胞24 h后的细胞活力,计算出药物对细胞的无毒浓度;测定JNK抑制剂SP600125（终浓度分别为25,12.5,6.25 μmol·L^-1）作用于细胞密度为5×10⁴个/mL的RAW264.7细胞24 h后的细胞活力,计算出SP600125作用的安全有效浓度;测定蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物（终质量浓度分别为5,2.5,1 mg·L^-1）作用于LPS诱导细胞密度为5×10⁴个/mL的RAW264.7细胞12,24,36,48 h后的细胞活力,计算出药物抑制细胞增殖的浓度。采用蛋白质印迹（Western-blot）法测定蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物（5 mg·L^-1）作用于LPS诱导的RAW264.7细胞24 h后p-JNK（磷酸化c-Jun氨基末端激酶）蛋白、JNK蛋白和环氧化酶-2（COX-2）蛋白的表达变化。结果：蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物作用于LPS诱导的RAW264.7细胞,测定p-JNK,JNK,COX-2相对灰度值分别为：0.12±0.03,0.48±0.03,0.18±0.04,无药物作用的LPS诱导的RAW264.7细胞,测定p-JNK,JNK,COX-2,相对灰度值分别为：0.68±0.05,0.83±0.04,0.58±0.04,两组数据比较具有明显差异（P<0.01）。蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物抑制LPS诱导的RAW264.7细胞增殖,下调p-JNK,JNK,COX-2等炎性蛋白的表达。结论：蹄叶橐吾醇化乙酸乙酯萃取物抗炎机制通过JNK信号通路来完成。     

竹节参总皂苷通过NF-κB通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用研究

目的： 探讨竹节参总皂苷对脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用。方法：噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度的竹节参总皂苷对RAW264.7细胞活性的影响;一氧化氮（NO）试剂盒法检测竹节参总皂苷对LPS刺激RAW264.7细胞的NO释放量;酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1-β（IL-1β）分泌;逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,TNF-α,IL-1β mRNA的表达;免疫印迹法（Western blot）检测胞核内核转录因子-κB p65（NF-κB p65）蛋白表达。结果：竹节参总皂苷的安全用药范围为≤80 mg·L^-1;与LPS模型组相比,竹节参总皂苷各剂量组（0.1,1,10,40 mg·L^-1）均能显著降低LPS刺激下RAW264.7细胞NO,TNF-α和IL-1β分泌;竹节参总皂苷各剂量组（10,40 mg·L^-1）均能抑制iNOS,TNF-α,IL-1β mRNA表达和NF-κB p65蛋白表达。结论：初步证实了竹节参总皂苷对LPS致RAW264.7巨噬细胞炎症的保护作用,作用机制可能与 NF-κB通路有关。     

甘草黄酮对运动大鼠体内糖及脂肪组织RBP4mRNA表达的影响

目的： 本研究通过运动前补充甘草黄酮,观察力竭运动大鼠血糖、肝糖原、肌糖原及脂肪组织视黄醇结合蛋白4（RBP4）表达的影响。 方法： SD雄性大鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为安静对照组,运动对照组,运动ig低剂量甘草黄酮组（MGFL）,运动ig中剂量甘草黄酮组（MGFM）,运动ig高剂量甘草黄酮组（MGFH）。每天在运动前30 min ig 1次,连续ig 6周,6 d/周,低、中、高3 组的ig剂量分别为4,8,12 g·kg^-1·d^-1,对照组ig等量生理盐水。6周力竭训练结束后,处死大鼠。根据试剂盒的方法测定大鼠血清血糖、肝糖原、肌糖原的含量并且通过逆转录聚合酶链式反应测定大鼠附睾脂肪组织视黄醇结合蛋白4表达。 结果： 力竭游泳训练导致大鼠血糖、肌糖原和肝糖原含量在运动对照组和MGF低、中、高剂量组降低（P<0.05或P<0.01）,血糖含量分别降低至（4.81±0.24）,（5.31±0.12）,（5.78±0.22）,（5.92±0.18） mmol·L^-1,但血糖含量在MGF各组高于运动对照组,MGFH组血糖含量与运动对照组比较有显著性差异（P<0.05）;肌糖原含量分别降低至（0.91±0.16）,（0.98±0.14）,（1.34±0.12）,（1.46±0.23） mg·g^-1,其中MGFM,MGFH组与运动对照组比较有显著性差异（P<0.05）;肝糖原含量分别降低至（6.21±1.10）,（8.92±1.11）,（9.18±1.13）,（10.16±1.16） mg·g^-1,MGF各组肝糖原含量分别高于运动对照组（P<0.05或P<0.01）。力竭游泳运动和MGF各组导致大鼠附睾脂肪组织RBP4 mRNA表达水平分别升高至（1.430±0.123）,（1.101±0.103）,（0.962±0.112）,（0.926±0.101）,其中运动对照组RBP4 mRNA表达水平与安静对照组比较有显著性差异（P<0.05）,其中MGFM和MGFH组大鼠附睾脂肪组织RBP4 mRNA表达水平降低,与运动对照比较有显著性差异（P<0.05）。 结论： 补充甘草黄酮后可以维持长时间运动过程中大鼠体内糖储备、血糖浓度的相对稳定和下调RBP4 mRNA表达水平,从而有利于提高机体的运动能力。     

三黄方对LPS诱导RAW264.7炎症因子分泌的影响

目的: 观察三黄方对脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子的影响,探讨其抗炎作用机制。 方法: CCK-8法测定大黄、黄芩、黄柏及三黄方对RAW264.7细胞的毒性作用,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中的一氧化氮（NO）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素₂（PGE₂）、肿瘤坏死因子-1α（TNF-1α）的含量。 结果: 三黄方可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放细胞炎症因子NO,IL-1β,PGE₂,TNF-1α的量,且三黄方的作用均强于各药单独使用。 结论: 三黄方及方中大黄、黄芩、黄柏在浓度范围100~1.562 5 mg·L^-1对RAW264.7细胞无显著毒性。三黄方通过抑制细胞因子NO,IL-1β,PGE-2,TNF-1α释放发挥其抗炎作用的。     

鳖甲煎丸通过HIF-1α/NF-κB信号通路调控巨噬细胞极化的机制探讨

目的 探讨鳖甲煎丸通过调控巨噬细胞极化防治肝纤维化的作用和机制。方法 运用血清药理学方法，体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7，通过氯化钴（CoCl₂）刺激RAW264.7细胞建立体外缺氧模型，将细胞随机分为空白组、CoCl₂模型组（200 mmol·L^-1）、鳖甲煎丸低（0.55 g·kg^-1）、中（1.1 g·kg^-1）、高（2.2 g·kg^-1）和扶正祛瘀胶囊组（0.56 g·kg^-1扶正祛瘀胶囊）。采用细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测各组细胞增殖水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测巨噬细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6 mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测巨噬细胞极化相关蛋白与HIF-1α/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路相关蛋白表达水平；细胞免疫荧光检测NF-κB信号通路相关蛋白、HIF-1α的分布及表达。结果 与空白组比较，CoCl₂刺激24 h后，RAW264.7细胞增殖受抑制明显（P<0.05）；与模型组比较，用相应含药血清处理24 h后，各用药组能促进RAW264.7细胞增殖（P<0.05）。与空白组比较，模型组HIF-1α、IL-1β、IL-6 mRNA表达均有明显升高（P<0.05）；与模型组比较，鳖甲煎丸与扶正祛瘀胶囊处理后能不同程度的降低巨噬细胞中HIF-1α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达水平（P<0.05）。与空白组比较，模型组HIF-1α及M1巨噬细胞表型蛋白IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达明显升高（P<0.05），M2巨噬细胞表型蛋白IL-10表达明显降低（P<0.05）。与模型组比较，鳖甲煎丸与扶正祛瘀胶囊组HIF-1α、IL-6、TNF-α蛋白表达降低（P<0.05），CD163、IL-10蛋白表达升高（P<0.05）。与空白组比较，模型组NF-κB p65、磷酸化（p）-NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶α/β（p-IKKα/β）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（p-IκBα）蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，鳖甲煎丸与扶正祛瘀胶囊组NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IKKα/β、p-IκBα蛋白表达明显降低（P<0.05）。与空白组比较，模型组促进HIF-1α和NF-κB p65的入核表达；与模型组比较，鳖甲煎丸和扶正祛瘀胶囊组能抑制HIF-1α和NF-κB p65的入核表达。结论 鳖甲煎丸可调控巨噬细胞极化，减轻缺氧环境下巨噬细胞相关炎症反应损伤，从而延缓肝纤维化进展，其机制可能与其调控HIF-1α/NF-κB信号通路有关。     

京尼平苷对光老化HaCaT细胞的保护作用及机制

目的：研究京尼平苷对光老化HaCaT细胞的保护作用及其机制。方法：取对数生长期的HaCaT细胞,调整其密度为1×10⁶个/mL接种于6孔板、5×10⁴个/mL接种于96孔板,用总剂量64 mJ·cm^-2（照射强度0.61 mW·cm^-2×照射时间105 s）的紫外线B（UVB）照射细胞建立光老化模型,以5×10^-5,5×10^-6,5×10^-7mol·L^-1的京尼平苷处理光老化细胞24 h,分别检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量,RT-PCR法检测细胞中P38、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素6（IL-6）mRNA的表达量,酶联免疫法检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。结果：UVB照射HaCaT细胞后,SOD活性、GSH-Px活性明显降低,MDA含量、p38 mRNA表达量、TNF-α和IL-6 mRNA及蛋白的表达量明显升高（P<0.01）;5×10^-5,5×10^-6mol·L^-1京尼平苷处理细胞后,SOD活性升高为（34.72±2.03）,（38.96±3.56） U·mg^-1;GSH-Px活性升高为（28.11±2.76）,（40.02±3.63）U·mg^-1;MDA含量下降为（4.82±0.42）,（4.60±0.41）nmol·mg^-1,p38 mRNA的相对含量下降为（0.97±0.09）,（0.94±0.09）;TNF-α mRNA的相对含量下降为0.57±0.05,0.53±0.05;IL-6 mRNA的相对含量下降为0.65±0.06,0.64±0.06;TNF-α蛋白的表达量降低为（34.05±2.43）,（25.55±1.84） ng·L^-1,IL-6蛋白的表达量降低为（28.51±1.95）,（19.32±1.55） ng·L^-1,与模型对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论：京尼平苷能抵抗UVB对HaCaT细胞的损伤,其机制可能与抑制氧化损伤,调控p38信号通路,调节TNF-α和IL-6的表达有关。     

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS探究朱日亨滴丸抑制巨噬细胞泡沫化的谱效关系

目的 通过对朱日亨滴丸（ZRH）的肠吸收液物质组成与抑制巨噬细胞泡沫化进行相关性分析,探究ZRH的药效成分群,为建立其质量标准提供依据。方法 采用大鼠外翻肠囊法制备ZRH的0、5、10、15、20倍临床等效剂量肠吸收液,并使用氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化模型,通过油红O染色及胆固醇含量测定考察不同剂量ZRH肠吸收液对RAW264.7细胞脂质积累的影响,筛选最佳剂量;采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）对ZRH肠吸收液中的肠吸收组分进行分析鉴定,以峰面积为自变量,药效指标为因变量,采用SIMCA 13.0软件对不同剂量ZRH肠吸收液进行偏最小二法-乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）,筛选变量重要性投影（VIP）值>1.0的化合物作为贡献性成分,并利用Pearson相关性分析确定谱效相关性;使用分子对接验证过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）、PPARγ、PPARβ、人视黄醇X受体α（RXRA）和核转录因子-κB（NF-κB）与ZRH肠吸收液中活性成分的结合能;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测RAW264.7细胞中PPARγ、A类Ⅰ型清道夫受体（SRA1）和三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法（Westen blot）检测RAW264.7细胞中PPARγ蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测RAW264.7细胞中白细胞介素（IL）-1β和NF-κB水平。结果 油红O染色、胆固醇含量测定结果显示,ZRH肠吸收液均能够降低巨噬细胞泡沫化程度,以15倍和20倍ZRH肠吸收液效果最佳,最终确定以15倍ZRH肠吸液作为研究对象。谱效关联分析显示,ZRH含药肠液中有52个对应峰与药效呈正相关,包括有机酸类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类、胆汁酸类、香豆素类和色酮类。分子对接靶标验证结果显示,86.9%~96.2%的成分与关键靶点PPARα、PPARγ、PPARβ、RXRA和NF-κB具有良好的结合活性,对接能量值均<-6.0 kcal·mol^-1（1 cal≈4.19 J）;验证结果显示,与正常组比较,模型组SRA1、PPARγ mRNA表达水平显著上升,ABCA1 mRNA表达水平显著下降,PPARγ蛋白表达水平显著上升,IL-1β、NF-κB水平显著上升（P<0.01）;与模型组比较,15倍肠吸收液组SRA1、PPARγ mRNA表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）,ABCA1 mRNA表达水平显著上调,IL-1β、NF-κB水平显著降低（P<0.01）,PPARγ蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 该研究确定了ZRH肠吸收液中52个与抑制巨噬细胞泡沫化呈正相关的药物成分及其代谢产物,可能与调节细胞中PPARs通路并降低炎症因子水平有关,为ZRH的质量控制和临床应用提供借鉴。     

刺五加P450基因原核表达体系的建立与表达条件的优化

根据已克隆得到的刺五加P450基因的cDNA序列设计引物,构建刺五加P450基因的原核表达载体pET30a-P450,并对重组菌株BL21/pET30a-P450的原核表达条件进行了筛选优化.实验结果显示,pET30a-P450转化大肠杆菌BL21后可实现P450基因的原核表达,SDS-PAGE分析显示其在53 kDa处有显著诱导条带;表达体系的最佳诱导温度为27～37℃,最佳IPTG浓度为1 mmol·L-1,最佳培养基为LB液体培养基,最佳诱导时间为24h.因此,刺五加P450基因能够通过表达载体BL21/pET30a-P450实现该基因的原核表达,该体系的诱导温度、IPTG浓度、培养基种类以及诱导时间均可影响目的蛋白的表达量,但影响强度不同.     

穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达

从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子,命名为ApNAC1,Gen Bank注册号为KY196416。生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972 bp,编码1个323个氨基酸的多肽,预测蛋白相对分子质量为35.9 k Da,等电点为6.14。原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中,是一个核定位蛋白。实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致:主要在穿心莲的叶片里表达,而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平。ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达,并且被成功纯化。该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础。     

白木香AsMAPK3基因的原核表达及其在洋葱表皮瞬时表达体系中的定位研究

目的构建国产沉香基原植物白木香AsMAPK3基因的原核表达载体,诱导重组蛋白正确表达,并研究AsMAPK3的亚细胞定位情况,为抗体制备准备材料,为筛选其互作蛋白及进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR方法克隆AsMAPK3基因的部分编码序列,构建重组原核表达载体pET-28a-AsMAPK3,并诱导蛋白表达。克隆AsMAPK3基因全长编码区,构建绿色荧光蛋白(GFP)瞬时表达载体pAN580-AsMAPK3,通过基因枪法转化洋葱表皮,荧光显微镜观察GFP的发光情况。结果含有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃经0.5 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,可获得相对分子质量约为39 000的融合蛋白,该融合蛋白在上清和包涵体中均有表达。瞬时转化洋葱表皮的GFP荧光观察发现,AsMAPK3主要在细胞核和质膜表达。结论成功实现了AsMAPK3的体外表达和纯化,明确了AsMAPK3的亚细胞定位,为后续开展其功能研究奠定了基础。     

红花bZIP20转录因子基因的克隆、表达分析及植物表达载体构建

目的克隆红花花瓣中b ZIP20(Basic region/leucine zipper motif)基因,研究其在不同组织中的表达量并构建其植物表达载体。方法根据红花转录组测序结果挑选b ZIP基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增b ZIP20基因开放阅读框(ORF)片段,利用RT-PCR法分析在红花不同组织以及尖孢镰刀菌侵染后红花根部b ZIP20基因的表达量,同时构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。结果 b ZIP20基因ORF长981 bp,编码326个氨基酸(Gen Bank登录号为KT692605)。红花b ZIP20与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其与芝麻、野茶树的氨基酸序列相似性高达85.41%和83.99%。实时荧光定量PCR分析表明,b ZIP20基因在不同组织中的表达水平具有显著差异,在花中呈现高表达,而在其他组织中低表达。接种尖孢镰刀菌的红花根部组织中b ZIP20基因的表达显著上调。结论成功地对b ZIP20基因进行克隆及表达分析,并构建植物表达载体p BASTA-b ZIP20。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为...     

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。     

刺五加鲨烯环氧酶基因家族2成员表达特性的分析

刺五加的鲨烯环氧酶(SE)基因家族存在2个成员。 为了探明其表达特性,利用实时荧光定量PCR技术,分析刺五加SE1,SE2在不同生长发育时期、器官和茉莉酸甲酯(MeJA)处理对其表达及皂苷含量的影响。结果表明,刺五加SE2在各时期、器官中表达量均显著高于SE1。在整个生长期中SE1表现为低-高-低的特点,SE2则表现出随着生长的进行而显著降低的变化趋势,两者均在根中的表达量最低,MeJA处理对SE1的提升水平显著高于SE2。刺五加的皂苷含量与SE1表达量间的相关系数为0.858,呈显著的正相关关系(P<0.05),而SE2未达显著水平。说明SE1是催化刺五加三萜皂苷生物合成的关键酶。     

干旱胁迫对柴胡中皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响

为了探究干旱胁迫对柴胡皂苷合成关键酶基因表达和皂苷含量的影响,以期从终产物,基因水平揭示柴胡皂苷合成对环境变化的响应。该研究以定植5个月的柴胡苗为研究材料,通过添加聚乙二醇(PEG)模拟干旱环境,利用HPLC测定不同胁迫程度下,柴胡根中皂苷a和d含量的变化,同时以β-tubulin为内参基因,采用荧光实时定量PCR(RT-q PCR)分析皂苷合成途径中4个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI),法尼基焦磷酸合酶(FPS)和β-香树素合成酶(β-AS)基因的表达。通过研究发现,干旱胁迫处理显著提高了柴胡中皂苷的含量,且当PEG为10%时,柴胡皂苷a和d质量分数最高,分别达到0.648%,0.781%;同时,各基因表达量结果显示,4个关键酶基因的表达均呈现不同程度的上调,其中FPS和β-AS上调极显著(P0.01);此外,相关性分析表明,HMGR,IPPI,FPS,β-AS的表达量和皂苷含量间存在显著正相关关系。因此,干旱胁迫下,柴胡通过调节皂苷合成关键酶基因的表达,来调节次生代谢物皂苷的合成,从而对逆境做出响应。