纳米载体组氨酸接枝聚介导的 shRNA 对大鼠肝脏 MyD88基因表达的干扰作用

目的：研究应用纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）（HGPAEs）介导的RNA干扰技术对大鼠肝脏髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）基因表达的抑制作用。方法构建HGPAEs及针对大鼠MyD88基因的shRNA（ small hairpin RNA）质粒,并将二者耦合成pMyD88-HGPAEs载体,分别设置生理盐水组、HGPAEs 组、pHK-HGPAEs 阴性对照组、shRNA 组和pMyD88-HGPAEs干预组,通过门静脉注射方法体内转染大鼠肝脏,分别采用荧光定量PCR技术和蛋白印迹法（ Western blot ）检测转染后的MyD88转录水平及蛋白表达水平。结果成功构建载shRNA质粒的HGPAEs载体,体内转染大鼠肝脏后,shRNA组及pMyD88-HGPAEs干预组MyD88基因表达水平差异具有统计学意义（P＜0．05）。与其他4组相比,pMyD88-HGPAEs干预组MyD88基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平显著下降（ P＜0．01）,而生理盐水组、单纯HGPAEs组、pHK-HGPAEs阴性对照组转染后MyD88基因mRNA转录水平及蛋白表达水平差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论 HGPAEs是一种较为理想的基因转运载体,应用针对大鼠MyD88基因的载shRNA质粒的HGPAEs载体,经门静脉注射方法转染大鼠肝脏可显著性抑制MyD88基因表达,本实验成果的取得为下一步动物实验提供一定的资料。     

突变MyD88重组质粒的构建及其抑制绿脓杆菌诱导的A549细胞IL-8表达

构建突变MyD88真核表达质粒(MyD88 DN),转染人呼吸道上皮细胞株A549,探讨其对绿脓杆菌及其分泌产物刺激IL-8表达的影响.结果显示突变MyD88成功构建入pcDNA3.1/zeo真核表达质粒,转染A549细胞后,可降低绿脓杆菌培养上清或活菌刺激诱导的IL-8分泌.提示突变MyD88可阻断绿脓杆菌感染引起的呼吸道上皮细胞IL-8释放,为呼吸道炎症的基因治疗提供了新的靶基因.     

Sp3对β-catenin基因转录调控作用初探

 目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子（-410/-1 bp）报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化。结果:（1）Sp1表达质粒在0.4 μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4 μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍。（2）0.4 μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化。（3）共同转染Sp1 0.3 μg与Sp3 0.1 μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强。结论: Sp3能促进β-catenin基因启动子（-410/-1 bp）的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路。     

MyD88缺去突变基因转染降低病原菌感染的人呼吸道上皮细胞IL-8的分泌

白细胞介素-8（1L-8）是呼吸道炎症反应的重要介质。本实验通过构建突变MyD88真核表达质粒（MyD88 DN），转染人呼吸道上皮细胞株A549及SPC-A-1，探讨其对病原菌感染上皮细胞IL-8表达的影响。结果显示：MyD88 DN转染可降低结核杆菌、绿脓杆菌培养上清诱导的IL-8释放；对肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌活菌侵袭细胞所刺激的IL-8分泌也有明显的阻断作用。提示突变MyD88能够阻断细菌感染引起的呼吸道上皮细胞IL-8表达，可能成为呼吸道严重炎症反应基因治疗的新靶基因。     

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用.方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrin mRNA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69.结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrin mRNA和蛋白表达水平以及启动子活性.Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性.结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达.     

髓样分化因子88与人卵巢癌紫杉醇耐药细胞系A2780/Taxol耐药性相关

目的 本研究希望通过外源改变MyD88的表达,明确其与紫杉醇耐药的相关性,检测MyD88对细胞生物学活性的影响.方法 通过在A2780/Taxol细胞中敲低和过表达MyD88后,利用real-time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测MyD88的表达变化;CCK-8法检测细胞转染前后对紫杉醇耐药性的变化,流式技术检测MyD88对细胞周期和凋亡的影响.结果 敲低MyD88表达水平,耐药细胞系A2780/Taxol对紫杉醇的耐药性明显降低(P＜0.01),抗凋亡能力减弱(P＜0.01);过表达MyD88后,细胞对紫杉醇耐药性增加(P＜0.05).结论 抑制卵巢癌细胞中MyD88的表达,能促进耐药细胞系对紫杉醇的敏感性,为临床卵巢癌耐药患者以MyD88为靶向的基因治疗提供了新思路和手段.     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。方法构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体,PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组(DMEM完全培养液)、DMEM加入polybrene组、EN.iS(Enhance infection solution)组、EN.iS加入polybrene组。荧光显微镜下观察不同组的转染效率,采用Real-timePCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。结果病8毒滴度为1×10TU/ml,MOI为100时,PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高,转染试剂polybrene对转染效率无明显影响,沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。结论慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段,可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。     

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。     

柯萨奇病毒A组16型的3C蛋白抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导

目的探讨柯萨奇病毒A组16型对RIG-Ⅰ介导的信号通路的影响。方法将带有IFN-β启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞,之后用CA16感染细胞,24 h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞,在感染6 h、12 h、24 h以及48 h后用Real-time PCR方法测定细胞中IFN-β的mRNA的表达水平。将pIFN-β-luc和pRL-CMV以及表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后检测报告基因活性。将带有绿色荧光蛋白GFP的IRF3质粒和表达RIG-I基因N端质粒以及表达CA16的3C蛋白共转染细胞,24 h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质间相互作用。结果 CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调,CA16的3C蛋白抑制了RIG-I诱导的IFN-β的启动子活性以及IRF3的核迁移,CA16的3C蛋白与RIG-Ⅰ存在相互作用。结论 CA16的3C蛋白通过与RIG-Ⅰ相互作用从而抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导。     

药物AC-88的抗肿瘤作用和对荷瘤小鼠T细胞的Fas、NF-кB/I-KB的影响

为了研究AC-88的抗肿瘤作用和机制,本文以移植H22肝癌细胞的小鼠为模型,应用Western blot等技术,研究了AC-88对肿瘤的抑制作用和对荷瘤小鼠T细胞的NF-кB、I-кB及Fas的影响.我们发现AC-88的抑瘤率可高达70%以上,能下调T细胞上Fas的表达.并能促进I-кB的降解,使NF-кB的核内转移增加.可见AC-88有良好的抑瘤作用,并能调节NF-кB的信号转导,减少T细胞的自身凋亡.     

MyD88 RNA干扰抑制小鼠骨髓树突状细胞成熟的实验研究

目的：针对小鼠骨髓树突状细胞（DC）髓性分化因子88（MyD88）,采用RNA干扰技术抑制其合成,观察脂多糖（LPS）刺激后DC生物学活性的变化,探讨获得耐受性DC的方法,为DC的临床应用提供新思路和理论依据。方法：培养小鼠骨髓源性DC,分为对照组、LPS组及RNA干扰组,对照组不予任何处理,LPS组加入终浓度为1μg/ml的LPS,RNA干扰组于加入MyD88 siRNA12小时后给予1μg/mlLPS刺激,继续培养3天。免疫细胞化学检测DCMyD88、核因子-κB（NF-κB）的表达,Western blot检测DCMyD88的表达;流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的变化,ELISA法检测各组DC分泌TNF-α。IFN-γ和IL-12的浓度,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力。结果：LPS促进DC高表达CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子,促进Th1型细胞因子释放、MyD88高表达及NF-κB核移位,并诱导T细胞增殖,MyD88 siRNA可阻断LPS的这些效应。结论：MyD88 siRNA可抑制DC成熟,产生耐受性DC,增强同种未成熟DC的免疫耐受诱导作用,为进一步研究DC的临床应用奠定了基础。     

RNA干扰抑制MyD88表达对小鼠骨髓树突状细胞生物学活性的影响

目的:采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓树突状细胞(DC)髓样分化因子88(MyD88)的表达,并检测其对细胞生物学活性的影响,为DC的临床应用奠定基础。方法:针对MyD88基因,采用化学合成法合成3对MyD88 siRNA(序列1、序列2及序列3),并转染DC2.4细胞。采用半定量RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测DCMyD88的表达情况,筛选其中一对高效RNA(序列3)转染DC2.4细胞(RNA干扰组),以未转染RNA的DC2.4细胞作为对照组,分别给予1 mg/L的脂多糖(LPS)刺激。流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的变化,ELISA法检测DC分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-12(IL-12)的浓度,免疫细胞化学检测DC核因子-κB(NF-κB)的表达,混合淋巴细胞培养检测T细胞增殖能力,观察RNA干扰对LPS促DC成熟的影响。结果:与空白对照组相比,序列2组及序列3组DC的mRNA和蛋白质表达分别降低90%和85%、92%和88%,差异有统计学意义;脂质体对照组、无义siRNA对照组及序列1组DC的mRNA和蛋白质表达无显著差异。经LPS刺激后,与对照组相比,RNA干扰组CD80、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达,TNF-α、IFN-γ及IL-12的浓度及T细胞增殖能力均显著下降,且未见明显NF-κB核转位。结论:RNA干扰技术能显著下调小鼠DC MyD88的表达,并显著抑制LPS促DC成熟的效应,为以DC MyD88为靶向、相关疾病的基因治疗提供了新思路和手段。     

MyD88-铜绿假单胞菌表位核酸疫苗的构建及其真核表达

目的:构建重组MyD88基因的铜绿假单胞菌(PA)表位核酸疫苗,并研究其在真核细胞中的表达.方法:将PA的OprF的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,表位之间用赖氨酸间隔,采用重叠PCR方法合成全基因,并在此序列前插入组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽基因,将获得的片段与MyD88基因分别克隆到pIRES载体的两个多克隆位点,构建真核双表达重组质粒pIRES-tPA-OprF-MyD88.电穿孔法将pIRES-tPA-OprF-MyD88转入COS-7细胞,通过Western blot检测其细胞上清tPA-OprF蛋白及细胞内MyD88蛋白的表达.结果:构建的真核表达质粒pIRES-tPA-OprF-MyD88,经电转COS-7细胞后,在其培养的上清液及细胞内检测到目的蛋白.结论:成功构建pIRES-tPA-OprF-MyD88表达载体,并在转染的真核细胞中得以有效地表达,为研究PA预防性疫苗奠定了实验基础.     

Toll样受体与适应性免疫

TLRs作为固有免疫系统的模式识别受体之一,识别PAMP这一多种微生物共有分子,在固有免疫中占据重要地位。此外,TLRs又以多种机制参与适应性免疫的调节。TLRs调节作用发挥的正常与否,直接关系到适应性免疫反应的结局。对TLRs的深入研究可以为感染和肿瘤等疾病的治疗开辟新的途径。     

SIGIRR对H292细胞Toll样受体4、5、9致炎作用的影响及机制研究

目的 观察SIGIRR(sigh Ig IL-IR-related molecule)对人气道上皮细胞株H292中Toll样受体(TLR)4、5、9致炎作用的影响,并初步了解其作用机制.方法 运用脂质体转染的方法,将SIGIRR-EGFP融和蛋白真核表达载体稳定转染H292细胞,通过免疫细胞化学技术观察H292细胞中SIGIRR的过表达情况;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006处理后,ELISA检测重组质粒(SIGIRR-EGFP)、空质粒(pEGFP-N1)转染以及未转染的H292细胞分泌致炎因子TNF-a和IL-6水平;通过免疫共沉淀的方法了解SIGIRR与MyD88之间的关系.结果 激光共聚焦显微镜显示重组融合蛋白SIGIRR-EGFP与H292内源SIGIRR共定位于细胞膜上;经LPS、Flagellin、CpG DNA 2006刺激后,重组质粒转染的H292细胞分泌的IL-6和TNF-a水平显著低于空质粒转染和未转染的H292细胞(P＜0.01);免疫共沉淀提示H292细胞受到刺激后,SIGIRR与MyD88有较强相互作用,可与TLR4、5、9竞争结合MyD88分子.结论 SIGIRR对H292细胞TLR4、5、9致炎通路的负性调节作用,可能是通过减少MyD88分子与TLR4、5、9的结合,从而削弱了炎症信号的细胞内转导.     

黄芩苷对结核分枝杆菌作用下TLR2-MyD88信号通路的影响

目的:观察黄芩苷是否存在对TLR2和MyD88的调节,以探寻其抗结核的可能作用机制。方法:取黄芩苷单体作用于感染结核杆菌的U937单核巨噬细胞,分别采用RT-QPCR、Western blot和FCM方法检测用药前后TLR2和MyD88的表达。结果:与对照组相比,模型组TLR2及MyD88表达均显著降低(P<0.05);而与模型组相比,黄芩苷组TLR2及MyD88 mRNA表达则显著增高(P<0.05),TLR2蛋白表达亦显著增高(P<0.05)。结论:黄芩苷具有上调TLR2和MyD88的作用,从而为黄芩苷抗结核机制的揭示提供了依据。     

对叶百部碱在结核分枝杆菌作用下Toll受体2-MyD88信号通路的影响

目的观察对叶百部碱对Toll样受体2（TLR2）和MyD88的调节作用，以探寻其抗结核的可能作用机制。方法取对叶百部碱单体作用于感染结核杆菌的U937单核巨噬细胞，分别采用RT．QPCR、WesternBlot和FACS方法检测用药前后TLR2和MyD88的表达差异。结果实验结果显示对叶百部碱具有上调TLR2和MyD88的作用。结论对叶百部碱抗结核作用可能通过调节TLR2-MyD88信号通路而发挥作用。     

Toll样受体信号通路中MyD88的研究进展

MyD88是Toll样受体信号通路中的重要转导蛋白,其依赖的信号通路以及调控的基因产物在固有免疫和适应性免疫中均发挥着关键作用。本文对MyD88及其依赖的信号通路做一简要综述,以期为临床预防和治疗疾病提供新的思路和方法。