抗RANTES单抗联合环孢素诱导小鼠二次移植心脏长期存活

目的探讨抗RANTES单克隆抗体(单抗)联合环孢素(Cs A)在抗小鼠心脏二次心脏移植排斥反应中的作用。方法以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体构建小鼠心脏二次移植模型。按随机数字表法分为4组:对照组(生理盐水组)、实验A组(抗RANTES单抗治疗组)、实验B组(Cs A治疗组)及实验C组(抗RANTES单抗+Cs A联合治疗组),每组6只。观察各组小鼠二次移植心脏存活时间;应用组织病理学观察各组移植心脏急性排斥反应的程度;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测移植心脏组织中RANTES、白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ和转录生长因子(TGF)-β基因的信使核糖核酸(mRNA)的相对表达量;采用酶链免疫吸附试验(ELISA)检测RANTES、IFN-γ、IL-2、IL-10和TGF-β在血清中的含量。结果所有实验小鼠二次心脏移植全部成功复跳。与对照组比较,实验A、B、C组的移植心脏存活时间明显延长(均为P0.01)。移植心脏病理学染色可见,实验C组炎症细胞的浸润较对照组、实验A组、实验B组明显减少。与其它3组比较,实验C组的移植心脏组织RANTES、IFN-γ、IL-2的mRNA表达量均明显减少,而IL-10、TGF-β的mRNA表达量均明显增加(均为P0.05)。与其它3组比较,实验C组的血清中RANTES、IL-2、IFN-γ含量均明显降低,而血清中IL-10、TGF-β含量均明显升高(均为P0.05)。结论联合应用抗RANTES单抗和Cs A可更有效诱导小鼠对二次心脏移植的免疫耐受,延长移植物的存活时间。     

子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用

目的观察小鼠子宫内膜间充质干细胞对小鼠模型薄型子宫内膜的修复作用。方法选择8周龄动情期规律C57BL/6J小鼠共288只,随机分为空白对照组、模型对照组、干细胞移植组,每组96只。空白对照组不做任何处理;模型对照组宫腔注射95%乙醇损伤后立即原位注射PBS 0.1 ml,3 d后尾静脉注射PBS 1 ml;干细胞移植组宫腔注射95%乙醇损伤后立即原位注射子宫内膜间充质干细胞0.1 ml,3 d后尾静脉注射子宫内膜间充质干细胞1 ml,干细胞浓度为5×105/ml。每组根据取样时间(3 d、7 d、14 d、30 d)不同分为4小组,取样当日,半数小鼠子宫组织取样,4%多聚甲醛固定送检,进行子宫内膜厚度、HE染色、免疫组化等检测;另半数小鼠与确定有生殖能力C57BL/6J雄鼠合笼,进行生育力评估。结果干细胞移植组小鼠子宫内膜厚度在各时间点均显著厚于模型对照组(P<0.05),但与空白对照组仍有一定距离(P<0.05)。HE染色结果显示,干细胞移植后的受损子宫内膜上皮层及基质层均增厚,腺体增加。免疫组化结果显示,干细胞移植组角蛋白、波形蛋白、VEGF、ERα各项指标均有显著上升,与模型对照组有显著性差异(P<0.05)。生育力评估发现,模型对照组生育率接近于0(仅30 d亚组1例),而干细胞移植组生育率显著升高,30 d亚组生育率达50%,接近空白对照组(66.7%)。结论小鼠子宫内膜间充质干细胞对薄型子宫内膜有显著改善。     

腺病毒介导TGF-β 1转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血-再灌注损伤的保护作用

目的观察腺病毒介导TGF-β₁转基因联合FTY720对大鼠同种异体肺移植缺血-再灌注损伤(IRI)的影响。 方法采用改良的三袖套法吻合技术建立大鼠左肺原位移植模型。以SD大鼠为供受体,随机分为假手术对照组、空白对照组、空载体对照组、TGF-β₁组、FTY720组和TGF-β₁＋FTY720组,每组6只。移植肺再灌注后4 h,检测各项生理指标。 结果腺病毒介导TGF-β₁转基因组荧光现象显著,并确定1×10¹⁰ PFU TGF-β₁基因腺病毒载体为较优转染浓度。肺移植再灌注后4 h,与假手术对照组比较,空白对照组和空载体对照组出现典型的移植肺IRI症状,肺动脉血氧分压(PaO₂)明显降低,二氧化碳分压(PaCO₂)和湿/干重(W/D)比值明显升高,超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低,丙二醛(MDA)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显升高。与空白对照组和空载体对照组比较,TGF-β₁组、FTY720组和TGF-β₁＋FTY720组移植肺组织水肿和间质炎症等病理组织学现象明显减轻,PaO₂明显上升,PaCO₂和W/D比值明显下降,SOD活性明显增加,MDA含量、MPO活性和TNF-α含量明显降低。其中,联合处理组病理症状表现出更为明显的减轻趋势。 结论腺病毒介导TGF-β₁转基因联合FTY720能有效减轻大鼠同种异体肺移植IRI。     

七氟烷下调LSD1表达抑制胚胎干细胞的自我更新

目的:研究七氟烷通过下调赖氨酸去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1,LSD1)的表达影响小鼠胚胎干细胞的自我更新,导致细胞干性下调。方法:将E14小鼠胚胎干细胞随机分为4组(n=6):空白对照组、对照组+LSD1过表达组、七氟烷组和七氟烷+LSD1过表达组。前两组给予含有5%CO_2和21%O_2的混合气体,后两组给予4.1%七氟烷,均处理6 h。实时定量PCR及Western印迹法检测LSD1的表达水平,实时定量PCR检测干性基因Oct4、Sox2、Nanog的表达水平。结果 :与对照组相比,七氟烷组在干预后小鼠胚胎干细胞出现提前分化现象,LSD1及干性基因(Oct4、Sox2、Nanog)表达显著下降(P0.05)。LSD1过表达逆转七氟烷造成的小鼠胚胎干细胞LSD1及干性基因表达下调。结论:七氟烷可能通过下调小鼠胚胎干细胞LSD1的表达,抑制胚胎干细胞的自我更新,从而影响小鼠胚胎干细胞的正常增殖与分化。     

RNA干扰质粒沉默转化生长因子β_1对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响

目的 探讨转化生长因子β_1(TGF-β_1)的RNA干扰质粒(shRNA-TGF-β_1)对大鼠移植肾细胞外基质生成的影响.方法 预先构建shRNA-TGF-β_1.取SD大鼠肾脏,置于4℃肝素生理盐水中以强化缺血再灌注损伤,用于移植.切除Wistar大鼠左肾后移植入供肾,术中采用以流体力学为基础的肾脏基因转染技术进行质粒转染.实验分为4组.T组为质粒组,受者注射shRNA-TGF-β_1质粒;H组为空质粒组,受者注射空质粒;Y组为单纯移植组,受者仅行肾移植,不注射任何质粒;J组为假手术组,只打开腹腔切除左肾,不进行肾移植.移植术后1、2和3个月时,切取各组受者的移植肾,检测TGF-β_1、Ⅰ型胶原及其mRNA的表达,检测Ⅰ型胶原组织定位,观察移植肾细胞外基质的沉积.结果 J组大鼠肾脏组织中仅有少量的TGF-β_1 mRNA表达.H组及Y组TGF-β_1 mRNA的表达较高.术后1个月时,T组TGF-β_1 mRNA的表达显著低于其他各组,随着时间的延长,其表达有所升高,但仍显著低于H组及Y组.各组TGF-β_1的表达与TGF-β_1 mRNA的表达有相同的变化趋势.T组Ⅰ型胶原mRNA的表达低于H组和Y组.各组Ⅰ型胶原的表达与其mRNA的表达有相同的变化趋势,Ⅰ型胶原主要位于H组和Y组的皮质小管区及髓质间质区,肾小球部位相对较少.T组移植肾纤维化程度低于H组和Y组.结论 转染shRNA-TGF-β_1能抑制移植肾TGF-β_1的表达,减少细胞外基质的生成,在一定程度上预防移植肾纤维化.     

胚胎肝干细胞分离与移植治疗裸鼠急性肝损伤

目的 探讨胚胎肝脏原始/干细胞移植治疗急性肝功能损伤裸鼠的可能性与有效性.方法 酶消化法分离孕13.5 d的BALB/C小鼠的胚胎肝脏原始/干细胞,免疫荧光染色法及RT-PCR法鉴定AFP、Albumin、CK19、c-Met等肝系和胆系标志物,给四氯化碳(CCl4)诱发的肝毒性损伤的裸鼠尾静脉注射4×105个干细胞,于注射前和注射后第1、2、4、7天取裸鼠血清,测定肝功能指标,观察肝脏组织学的改善情况.结果 经分离可得到具有干细胞特点的胚肝原始细胞,治疗组裸鼠在干细胞移植后肝功能指标逐渐降低,第1、2、4天均低于对照组,治疗组裸鼠肝脏组织学的病理损伤的恢复比对照组快. 结论酶消化法能够分离得到较多胚胎肝脏原始/干细胞,并且具有一定的改善急性肝损伤裸鼠的肝功能及肝脏病理指标的作用.     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔腰椎间盘髓核细胞对蛋白多糖含量的影响

目的观察构建腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(humantransforminggrowthfac-tor,hTGF-β1)基因(Ad/CMV-hTGF-β1)转染到兔椎间盘髓核细胞后,髓核组织中蛋白多糖含量的变化。方法(1)纯种成年新西兰大白兔35只,其中25只对腰椎间盘髓核组织注射Ad/CMV-hTGF-β1,每只注射2个椎间盘作为实验组,注射量为每个腰椎间盘20μl(6×106pfu);同时每只取2个未做注射的腰椎间盘作为自身空白对照组。其余10只兔每只注射2个腰椎间盘各20μl磷酸盐缓冲液(PBS)作为实验对照组。全组共120个椎间盘。(2)手术后1～12周的不同时间段分别取出各组椎间盘组织,采用间苯三酚分光光度法测定髓核组织中蛋白多糖的含量,所得数据经SPSS10.0统计学软件进行统计学处理。结果(1)术后1周,实验组与自身空白对照组蛋白多糖测定值经配对t检验,t=3.968,P<0.05。(2)术后2周,三组结果经方差分析显示,F=17.871,P<0.01;各组间再行两两q检验,实验组与自身空白对照组间q=7.686,P<0.01;实验组与实验对照组间q=6.894,P<0.01;实验对照组与自身空白对照组间q=0.792, P>0.05。实验组与自身空白对照组间配对t检验,t=5.276,P<0.01。(3)术后4周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=8.352,P<0.01。(4)术后8周,实验组与自身空白对照组经配对t检验,t=7.086,     

输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞延长异种肝移植大鼠存活时间

目的 探讨人白细胞介素10(hlL-10)修饰的豚鼠骨髓间充质干细胞(hIL-10-MSCs)输注对异种肝移植大鼠存活的影响及其可能机制.方法 以携带hIL-10基因的慢病毒(hIL-10/LOX-ewGFP)为载体构建hIL-10-MSCs.以豚鼠为供者,Wistar大鼠为受者,制作非协调性异种原位肝移植模型,将受者随机分成3组,每组60只:空白对照组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射生理盐水和地塞米松1次;MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射MSCs和地塞米松1次;hIL-10-MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射hIL-10-MSCs和地塞米松1次.记录供者手术时间、供肝冷缺血时间、受者手术时间、肝上下腔静脉(SVC)吻合时间、无肝期及受者存活时间,测定术后各组受者血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量,酶联免疫吸附试验法测定各组受者移植肝组织中自细胞介素2(IL-2)、IL-4、hIL-10、IL-12、IL-15、IL-18和TGF-β1的含量,逆转录聚合酶链反应法检测各组受者移植肝组织中上述各细胞因子mRNA的表达.结果 hIL-10-MSCs组受者存活时间为(72.0±5.5)h,空白对照组和MSCs组受者的存活时间分别为(29.0±2.2)h和(48.0±4.6)h,前者明显长于后二者,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05).hIL-10-MSCs组移植肝组织中IL-4和TGF-β1mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),而IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 mRNA的表达明显低于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),hIL-10-MSCs组肝组织中hIL-10 mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组.结论 静脉输注hIL-10-MSCs可延长异种肝移植大鼠的存活时间,其机制可能与hIL-10-MSCs抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等细胞因子的表达,促进IL-4和TGF-β1的表达有关.     

骨髓干细胞转分化为肾祖细胞并参与修复急性肾脏损伤的研究

目的 观察骨髓干细胞是否可以向肾祖细胞转分化,成为肾脏祖细胞库的肾外来源;验证粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是否可以促进骨髓干细胞向肾脏祖细胞的转分化,提高肾脏修复的效能.方法 6周龄全身表达绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6J转基因小鼠提供骨髓,6~8周龄同种无荧光标记的C57BL/6J小鼠40只作为骨髓受体.骨髓移植前,受体小鼠接受致死剂量的γ放射线137Cs照射,骨髓重建情况经流式细胞仪检测确认.骨髓重建完毕后所有小鼠均接受单侧肾脏缺血再灌注损伤.干细胞动员效果及向肾脏归巢情况经流式细胞仪检测鉴定.损伤4、8周后取肾脏标本行免疫荧光组织化学染色,观察骨髓来源的肾脏祖细胞数以及骨髓细胞在微血管形成中的作用.损伤4周后通过组织切片免疫荧光组织化学方法观察并计数微血管细胞数.结果 G-CSF动员1 d后,分别为CD29、CD34、Sca-1、c-Kit、Flk-1阳性的干细胞占外周血非红系细胞的比例均高于对照组(P<0.05).损伤4周后,G-CSF动员组的肾脏中,骨髓来源并且分别表达Sca-1/GFP、CD29/GFP的干细胞的比例均高于对照组(P<0.05);在损伤4周及8周后,肾脏切片免疫荧光组织化学显示G-CSF动员肾脏中骨髓来源的肾祖细胞即Sca-1/GFP双阳性的细胞数量高于对照组.损伤4周后,动员组肾脏中表达CD31的微血管密度高于对照组(P<0.05).损伤4周后肾脏组织中存在CD105/GFP及α-SMA/GFP双阳性的细胞.结论 ①骨髓干细胞可以转分化为器官特异性干细胞-肾脏祖细胞;②G-CSF可以加速这一转分化的过程,并使损伤肾脏得到更好的修复.     

hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植术后的表达

目的 检测腺病毒介导的hTGF-β1基囚转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的表达。方法 兔骨髓间充质干细胞体外分离培养扩增,Ad-hTGF-β1转染后采用组织工程方法自体移植于椎间盘中,在术后1周、2周、4周、6周、8周取材,RT-PCR和免疫组化方法检测hT-GF-β1的表达。结果 在Ad-hTGF-β1转染MSCs移植组,RT-PCR可检测到hTGF-β1mRNA的表达,对照组未检测到hTGF-β1mRNA的表达,免疫组织化学染色结果显示,与对照组比较Ad-hT-GF-β1转染MSCs移植各组阳性细胞数量和灰度值均有非常显著性差异（P〈0．01）。结论 腺病毒介导的hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞椎间盘移植后hTGF-β1基因的可高表达。     

γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

人枯否细胞在同种肝移植免疫中作用机制初步探讨

目的 探讨肝脏枯否细胞(KC)在肝移植后早期免疫反应中的可能作用.方法 将KC和(或)异体PBMC共培养,收集细胞上清液,培养结束时分别收获培养的KC和PBMC.检测HLA-G在细胞表面的表达;测定上清液中NO、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的浓度;MTT试验观察KC对淋巴细胞增殖的影响.结果 实验组及对照组中KC和PBMC表面均未检测到HLA-G的表达.与不含KC实验组相比,含KC实验组中,NO、IL-10和TGF-β1的产量显著升高,而IFN-γ呈相对偏低趋势;对照组中未能检测到IL-10和IFN-γ的分泌,仅含KC的对照组中含少量NO及TGF-β1,且显著低于实验组.MTT实验发现,不含KC实验组OD值显著高于含KC实验组及对照组.结论 体外KC接触异体PBMC后早期,各细胞膜表面均无HLA-G表达,但参与了NO及Th2/Th3样细胞因子的分泌调节,并能抑制淋巴细胞增殖反应,可能促进肝脏移植早期免疫耐受的形成.     

第三方骨髓间充质干细胞诱导同种异体移植受体免疫耐受机制的研究

目的 初步研究第三方骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导同种异体移植受体免疫耐受的作用机制.方法 40只雌性C57BL/6小鼠作为供体,40只雄性BALB/C小鼠作为受体,建立稳定的同种异体皮肤移植模型,BMSCs取自SD大鼠骨髓.将40只BALB/C小鼠随机分为4组,每组10只.①空白对照组:只进行皮肤移植,未给予其他治疗;②环磷酰胺组(CP组):大剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.);③单纯给予SD-BMSCs移植组(SD-BMSCs组):移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs;④细胞药物联合应用组(CP+SD-BMSCs组):大剂量CP腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.),并于移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs.检测指标包括:移植皮片存活情况;SD大鼠BMSCs表面抗原CD29、CD34、CD45和CD90鉴定;流式细胞仪检测受体脾脏调节性T细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg细胞)的比例;ELISA检测受体外周血TGF-β、IL-10、IFN-γ的含量;异基因T淋巴细胞与经60Co照射的不同来源BMSCs共培养后,MTT法测定异基因T淋巴细胞增殖的情况.结果 CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间为(15.7 ±1.4)d,空白对照组为(6.1±1.1)d,CP组为(12.3±1.5)d,SD-BMSCs组为(12.6±1.8)d,CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间明显比后3组延长(P＜0.05).全骨髓贴壁培养的BMSCs表面抗原鉴定:CD29+、CD44+分别为99.7%和96.7%,CD34-、CD45-分别为1.6%和1.3%.流式细胞仪检测Treg含量SD-BMSCs组和CP+SD-BMSCs组明显高于空白对照组和CP组(P＜0.05);ELISA检测受体外局血SD-BMSCs组和CP组TGF-β和IL-10明显高于空白对照组,SD-BMSCs和CP组IFN-γ则明显低于空白对照组(P＜0.05);共培养结果显示:来源于C57小鼠和SD大鼠的BMSCs可以明显抑制T淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),而上述两组组间比较差异则无统计学意义(P＞0.05).结论 第三方BMSCs诱导同种异体移植免疫耐受作用可能与诱导受体Treg细胞增殖和促进免疫耐受因子的表达,抑制免疫排斥因子的表达有关.

Abstract：

Objective To study the immuno-tolerance mechanism of the third-party bone marrowderived mesenchymal stem cells ( BMSCs) in the allogeneic transplantation. Methods Forty female C57BL/ 6 mice and forty male BALB/C mice were respectively used as donors and recipients in skin allogenic graft model. Forty male BALB/C mice were divided randomly into 4 groups: blank control group, CP group, BMSCs group , CP + BMSCs group , with 10 mice in each group. Before skin graft, high-dose abdominal injection of cyclophosphamide ( 200 mg/kg,2 d,q. d. ) was performed in recipient mice in CP and CP + BMSCs groups. On the transplantation day, a bonus of 2 x 106 BMSCs from the SD rat (SD-BMSCs) were injected through the tail vein in the BMSCs and CP + BMSCs groups. The observation and HE staining of skin grafts were used. The expressions of CD29, CD34, CD45 and CD90 of cells were analyzed by using flow cytometry in order to identify BMSCs. The CD4+ , CD25+ , Foxp3+ and Treg cells of spleen were detected by flow cytometry. Cytokine in peripheral blood of recipient mice were measured by ELISA,including TGF-β, IL-10 and IFN-γ. T cells were co-cultured with 60 Co-irradiated bone marrow MSCs from different individuals. The proliferative activity of T cells were evaluated with MTT assay. Results The skin graft survival time was significantly prolonged in the CP + BMSCs group, as compared with that in the blank control group, the CP group, the BMSCs group, respectively. Cells cultured by whole bone marrow adherent cultivation showed CD29+ (99.7% ) ,CD44+ (96.7% ) ,CD34 (1.6% ) ,CD45( 1. 3% ). Compared with the control group and CP group, the ratio of the CD4+ ,CD25+ ,Foxp3+ and Treg cells significantly increased in the SD-BMSCs group and CP + BMSCs group (P ＜ 0. 05). Analysis of peripheral blood by ELISA showed significant high level of TGF-β, IL-10 and low level of IFN-γ in BMSCs group and CP group, compared with that in control group. When co-cultured with BMSCs from different individuals, T- lymphocytes proliferation decreased apparently in SD-BMSCs group and C57-BMSCs group (P ＜ 0. 05) , but there was no significant difference between SD-BMSCs group and C57-BMSCs group ( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The immunotolerance mechanism of the third-party bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the allogeneic transplantation might be associated with its effect on the proliferation of Treg cells and increasing expression of TGF-β and IL-10, decreasing expression of IFN-γ.     

体内注射白细胞介素10和转化生长因子质粒延长小鼠移植皮肤存活时间

目的 探讨体内注射白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)质粒对小鼠移植皮肤存活时间的影响.方法 构建含IL-10和TGF-β1基因的质粒,以Balb/c小鼠为受者、Balb/c小鼠与C57BL/6小鼠杂交的F1代小鼠为供者,行皮片移植.移植当天,经尾静脉分别给受者快速注射不含基因的空白质粒(空白组)、含IL-10基因质粒(IL-10组)、含TGF-β1基因质粒(TGF-β1组)以及含IL-10和TGF-β1双基因的质粒(联合组),以后每2天注射1次,20 μg/次,共注射6次,观察移植皮肤存活时间.另取Balb/c小鼠,在输注C57BL/6小鼠脾细胞后,按前述分组及方法接受质粒快速注射,注射5次后,分离其脾细胞,以流式细胞仪检测脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.结果 移植皮片存活时间,空白组为(13.50±1.04)d,IL-10组为(13.83±1.16)d,TGF-β1组为(15.33±1.50)d,联合组为(21.33±3.20)d,联合组移植皮片存活时间明显长于其他3组(P<0.01).脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞的含量,空白组为(6.58±1.86)%,IL-10组为(10.52±1.13)%,TGF-β1组为(14.44±0.42)%,联合组为(14.25±1.24)%,TGF-β1组和联合组的CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量明显高于空白组和IL-10组(P<0.01).结论 体内注射IL-10和TGF-β1质粒可延长小鼠移植皮肤存活时间,并能提高CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.     

腺苷酸环化激酶-雷帕霉素靶蛋白信号通路参与小鼠急性肾损伤的机制研究

目的 探讨腺苷酸环化激酶(AMPK)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路参与小鼠急性肾损伤的机制.方法 将健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及SB2111组,每组各10只.模型组与SB2111组小鼠采用脂多糖(LPS)建立急性肾损伤模型,对照组以等剂量的生理盐水代替.SB2111组另外给予经腹腔右侧注射2...     

输注供者自然杀伤细胞对小鼠单倍型相合造血干细胞移植的影响

目的 探讨输注供者自然杀伤(NK)细胞对小鼠单倍型相合造血干细胞移植的影响.方法 选取C57BL/6(H-2b)雄性小鼠为供者、CB6F1(H-2d/b)雌性小鼠为受者.移植前制备供者的骨髓细胞(BMC)、脾细胞(SC)及脾NK细胞,NK细胞经体外培养扩增和激活;所有受者均接受直线加速器X线全身照射(TBI)预处理.TBI后将受者分为4组(每组10只),分别进行单倍型相合造血干细胞移植.单纯TBI组:TBI后不输注细胞,仅作为对照;单纯BMC输注组:输注5×106个BMC;诱发GVHD组:输注5×106个BMC+1.5×107个SC;NK细胞输注组:输注5 x 106个BMC+1.5×107个SC+1×107个NK细胞,并腹腔注射100 ng重组人白细胞介素2(rhIL-2)和1μg rhIL-15,持续7 d.移植后观察各组受者GVHD的发生情况,并对各组受者进行组织病理学、供者细胞嵌合度和免疫功能重建等检测.另取TBI后受者20只,设白血病复发组和白血病治疗组,每组10只.白血病复发组:输注5×106个BMC+1×107个SC+2×106个白血病细胞株EL9611;白血病治疗组:在白血病复发组的基础上再输注1 x 107个NK细胞,并腹腔注射100 ng rhIL-2和1μg rhIL-15,持续7 d.观察两组受者白血病复发情况和移植后100 d的存活率.结果 单纯BMC输注组受者无GVHD发生,NK细胞输注组受者GVHD的评分和组织病理学改变均较诱发GVHD组轻(P<0.05)f诱发GVHD组的免疫功能重建较NK细胞输注组延迟.白血病复发组和白血病治疗组移植后100 d的存活率分别为20%和90%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 输注激活的供者NK细胞可以减轻小鼠单倍型相合造血干细胞移植后的GVHD,减少白血病复发,促进免疫功能重建.     

Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model

BACKGROUND: The use of cell transplantation as an alternative therapy for orthotopic liver transplantation has been widely anticipated due to a chronic donor shortage. We previously reported the method used to enrich hepatic progenitor cells (HPCs) forming cell aggregations. In this study, we transplanted HPCs into the liver injury model mice to determine whether HPC transplantation may improve the liver dysfunction. METHODS: We obtained donor cells from E13.5 fetal livers of green fluorescent protein (GFP) transgenic mice. We transplanted GFP-positive fetal liver cells into the transgenic mice which express diphtheria toxin (DT) receptors under the control of an albumin enhancer/promoter. Subsequently, we induced selective liver injury to recipient mice by DT administration. We then evaluated the engraftment of the transplanted cells and their effect on survivorship. RESULTS: The low dose of DT induced sublethal liver injury and the high dose of DT was lethal to the liver injury model mice. The transplanted GFP-positive cells were engrafted into the recipient livers and expressed albumin, resembling mature hepatocytes. They continued to proliferate, forming clusters. The survival rate at 25 days after transplantation of the cell-transplanted group (8 of 20; 40.0%) was improved significantly (P=0.0047) in comparison to that of the sham-operated group (0 of 20; 0%). CONCLUSIONS: The transplanted cells were engrafted and repopulated the liver of recipient mice, resulting in the improvement of the survival rate of the liver injury model mice. We therefore propose that HPCs are a desirable cell source for cell transplantation.     

Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function

Human amnion epithelial cells (hAECs) have attracted recent attention as a promising source of cells for regenerative therapies, with reports that cells derived from human term amnion possess multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory properties. Specifically, in animal models of lung disease characterized by significant loss of lung tissue secondary to chronic inflammation and fibrosis, the transplantation of hAECs has been shown to reduce both inflammation and subsequent fibrosis. To further explore the mechanisms by which hAECs reduce pulmonary fibrosis and enhance lung regeneration, we utilized a bleomycin-induced model of pulmonary fibrosis and investigated the ability of hAECs to reduce fibrosis and thereby improve pulmonary function. We aimed to determine if hAECs, injected into the peritoneal cavity could migrate to the lung, engraft, and form functional lung epithelium, and whether hAECs could modulate the inflammatory environment in the bleomycin-injured lung. We demonstrated that, compared to bleomycin alone, IP administration of hAECs 24 h after bleomcyin, decreased gene expression of the proinflammatory cytokines TNF-α, TGF-β, IFN-γ, and IL-6 and decreased subsequent pulmonary fibrosis with less pulmonary collagen deposition, reduced levels of α-smooth muscle actin and decreased inflammatory cell infiltrate. We also showed that hAECs are able to prevent a decline in pulmonary function associated with bleomycin-induced lung damage. We were unable to detect any significant engraftment of hAECs in injured, or uninjured, lung after administration. The findings from this study support the further investigation of hAECs as a potential cell therapy for inflammatory and fibrogenic diseases.     

Collagen breakdown during acute lung injury.

Injury to the capillary endothelium and to alveolar epithelial cells of the lung may result in damage to the underlying collagen of the extracellular matrix. To examine this possibility, whole body irradiation, bleomycin injections, and exposure to hyperoxia were used to induce various types of lung damage in mice. The morphology of the lung and the cellular and protein content of bronchoalveolar lavage fluid were used to assess injury. Collagen breakdown was assessed from the hydroxyproline concentrations in bronchoalveolar lavage fluid. When lung cell injury was observed, protein leaked in to alveoli and hydroxyproline was detected in bronchoalveolar lavage fluid. An increase in hydroxyproline followed endothelial damage by irradiation and was greatly increased when type 1 epithelial cell necrosis also occurred after bleomycin injection or hyperoxia. Maximal concentrations of hydroxyproline occurred in mice showing respiratory distress after six days of hyperoxia. Concentrations returned to zero during the subsequent phases of cell regeneration and fibrosis seen after bleomycin injection and irradiation. There was little change in the cellular components of bronchoalveolar lavage fluid at any time. The results indicate that collagen breakdown occurs during acute lung injury and can be quantified in terms of the hydroxyproline concentration in lavage fluid. Such a change in the extracellular matrix might influence the subsequent division and differentiation of regenerating cells during repair.