IFN-γ经共抑制分子B7-H1正向调控小鼠骨髓间充质干细胞免疫抑制的研究

目的 探讨IFN-γ通过137-H1/PD-1通路正向调节骨髓问充质干细胞(MSC)免疫抑 制作用机制,为MSC用于治疗免疫性疾病提供新的理论依据.方法 首先体外获得纯化鼠源MSC 并进行三向分化鉴定;间充质干细胞和淋巴细胞反应体系进行共培养,3H掺入试验测定细胞增殖水 平;ELISA检测共培养上清中IFN-γ、TGF-β、TNF-α、IL-10因子的表达水平;流式检测共培养中MSC B7-H1分子的变化;siRNA干扰MSC B7-H1后,3H掺入试验测淋巴细胞增殖水平的改变,采用Tr-answell培养方法 确认MSC通过细胞间接触发挥作用.结果 体外鼠源MSC经过5代的反复贴壁纯化之后,形态均一纯度高,并具有向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化的能力;MSC与混合淋巴细胞反应、Con A刺激的淋巴细胞反应以及anti-CD3/CD28刺激活化的淋巴细胞反应混合共堵养,3H掺入试验结果 均显示增殖反应被抑制(P=0.0167,0.0081,<0.0001),其抑制作用呈现对MSC细胞的剂量依赖;共培养上清中细胞因子IFN-γTNF-α均显著升高,而TGF-β、IL-10未检测到,同时共培养中MSC表面B7-H1分子明显表达上调(P<0.05);经B7-H1特异siRNA干扰MSC后,共培养并检测淋巴细胞增殖反应,细胞增殖水平明显较干扰前提高(P<0.05),Transwell膜分隔后MSC抑制干细胞活化明显减弱(P<0.05).结论 MSC经共培养环境中IFN-γ刺激后,表面B7一H1分子的表达上调并通过B7-H1/PD-1通路抑制T细胞活化增殖.将来这种MSC可以用于治疗多种自身免疫性疾病.     

Effects of RNA silenced HLA-A2 in hBMSCs on secretory function of human allogeneic T lymphocytes and osteogenic ability of hBMSCs

目的:探讨应用RNAi技术沉默HLA-A2表达的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)对人异体T淋巴细胞分泌功能的调节作用及诱导成骨能力的影响.方法:用siRNA转染至第3代hBMSCs将转染前、后各组的hBMSCs与PHA刺激的人异体T淋巴细胞共同培养,用ELISA检测各培养组上清液γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;对2组细胞进行成骨诱导分化培养,观察细胞形态变化;碱性磷酸酶染色、计数和Vor- Kossa染色、计数检测成骨能力.结果:hBMSCs表面抗原CD44、CD166阳性.转染前hBMSCs的HLA-A2表达为阳性,转染后hBMSCs的HLA-A2表达为弱阳性;转染前hBMSCs的HLA-A2蛋白表达量高于转染后的HLA-A2蛋白表达量.转染前、后的hBMBCs均能抑制人T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,转染前、后比较有差异.ALP染色显示转染前、后的hBMSCs均出现胞质呈棕黑色的阳性反应,ALP活性检测结果显示2组之间无差异.Vor-Kossa染色显示转染前、后的hBMSCs均有钙结节形成,统计2组之间无差异.结论:应用RNAi技术沉默HLA-A2表达的hBMSCs可以抑制PHA刺激人T淋巴细胞分泌因子IFN-γ、IL-2的水平,转染后的hBMSCs比未转染的hBMSCs抑制作用更强.应用RNAi技术沉默HLA-A2表达的hBMSCs,不影响其成骨能力.     

骨髓间充质干细胞的体外扩增及其对T淋巴细胞产生IFN-γ和IL-10的影响

为了探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对T淋巴细胞分泌功能的免疫调节作用,从人骨髓分离培养MSC,通过其形态的均一性及流式细胞术检测表面标志以鉴定其纯度;从外周血分离获得T淋巴细胞,再将MSC分别以不同数量加入到植物血凝素(PHA)刺激的外周血T淋巴细胞和混合淋巴细胞反应(MLR)培养体系及不同浓度MSC培养上清加入混合淋巴细胞反应培养体系共培养后,分别收集上清,ELISA检测IFN-γ和IL-10水平,发现不同细胞数量的MSC对T细胞分泌细胞因子IFN-γ均有抑制,同时促进IL-10分泌,且其抑制和促进均呈剂量依赖性;MSC的不同上清浓度对IFN-γ抑制亦呈浓度依赖性,但未发现对IL-10分泌的影响。表明骨髓MSC在体外可抑制T细胞分泌IFN-γ、促进分泌IL-10,起到免疫调节作用。     

Poly(I:C)影响间充质干细胞的成骨分化及其对树突状细胞的作用

目的:间充质干细胞(MSC)能够表达Toll样受体(TLR),但TLR配体刺激对MSC的影响依然存在争议.本研究分析了TLR3配体刺激对脐带MSC表型、细胞增殖、凋亡、成骨分化和功能的影响.方法:用混合酶法分离培养了人脐带来源的MSC;用流式细胞仪分析了TLR3配体—Poly(I:C)刺激后MSC表面标志CD29、CD44、CD105、CD31、CDl17和CD45表达的变化;用CCK-8和Annexin-V/PI法分别检测了不同浓度Poly(I:C)刺激24及48小时后MSC的增殖和凋亡情况;进一步分析了Poly(I:C)对MSC成骨分化的影响.此外在Poly(I:C)和MSC存在时,流式检测了DC成熟表面标志CD40、CD86、MHCⅡ的表达,DC对右旋糖酐的吞噬,混合淋巴实验检测了DC的抗原递呈能力.结果:Poly(I:C)的刺激不影响MSC的表型和增殖;只有高浓度组的Poly(I:C)刺激引起MSC的凋亡;Poly(I:C)抑制成骨相关基因RUNX2、ALP和OC的表达,抑制MSC的成骨分化;Poly(I:C)存在的情况下,MSC下调DC成熟表面标志CD40、CD86和MHCⅡ的表达,增强DC对右旋糖酐的吞噬能力,并抑制DC对T的活化作用.结论:Poly(I:C)能够影响MSC的成骨分化及免疫调节功能,提示TLR3信号的活化可能在成骨分化中发挥作用.     

MicroRNA-373 regulates the osteogenisis of human adipose tissue-derived Flk1 + mesenchymal stem cells

目的 用microRNA-373(miR-373)的模拟物转染人脂肪来源Flk1+间充质干细胞(MSC),探讨microRNA-373对Flk1+ MSC成骨分化的影响.方法 利用脂质体作为载体,用miR-373模拟物瞬时转染Flk1+ MSCs,然后对其进行成骨诱导,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色观察成骨情况,real-time PCR技术检测成骨标志性基因的表达.结果ALP染色和茜素红可见明显差异；real-time PCR检测结果显示,实验组(miR-373组)成骨标志基因runt相关转录因子2(RUNX2)(0.543±0.021)、ALP(0.556 ±0.024)和骨钙蛋白(OC) (0.499±0.017)的表达都明显低于对照组(NC组)(P＜0.05).结论 miR-373参与调控Flk1+ MSC向骨细胞分化.     

人脐血非造血干细胞免疫原性的实验研究

目的 探讨人脐血非造血干细胞免疫原性,为脐血非造血干细胞的应用提供依据.方法 通过流式细胞术检测人脐血非造血干细胞的免疫表型;体外混合淋巴细胞培养观察人脐血非造血干细胞原代、P1代、诱导分化细胞及干扰素-γ(IFN-γ)刺激异种T淋巴细胞增殖活化作用.结果 人脐血非造血于细胞表达HLA-ABC,微弱表达HLA-DR,经IFN-γ处理后,未明显改变HLA-ABC、HLA-DR的表达水平.混合淋巴细胞培养未见各处理组人脐血非造血干细胞明显刺激T淋巴细胞的增殖.结论 人脐血非造血干细胞无论原代、传代细胞、分化细胞及IFN-γ处理的细胞免疫原性均较弱.     

干扰素-γ对脂肪间充质干细胞免疫调节相关基因表达的影响

目的探讨IFN-γ对脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)免疫调节相关基因表达的影响。方法体外分离培养ADSCs,应用流式细胞术对3代细胞表面抗原CD14、CD34、CD45、CD90、CD105和HLA-DR进行检测;并将细胞置于骨和脂肪诱导分化培养基中进行诱导分化,检测其多向分化潜能。实验分为正常对照组和IFN-γ处理组(IFN-γ浓度1000 u/ml),处理24h后,通过实时定量PCR方法检测各组细胞免疫调节、趋化因子、粘附分子以及生长因子相关基因的表达情况。结果 IFN-γ处理后,显著上调2种免疫调节因子基因(IDO-1和HLA-G5)在ADSCs表达水平,显著上调2种粘附分子基因(ICAM-1和VCAM-1)表达水平,显著上调3种趋化因子基因(CXCL9、CXCL10和CXCL11)表达水平(0.01)。结论 IFN-γ刺激可以上调ADSCs部分免疫调节因子、粘附分子和趋化因子基因表达,对生长因子基因表达影响不大。     

#br# rhTGF-β1对SD大鼠MSCs骨向分化的影响及机制研究

 目的：通过观察重组人转化生长因子 β1(rhTGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和骨向分化能力的影响,以及对骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Smad4及核心结合因子α1(Cbfa1)的作用,阐释其对MSCs骨向分化影响以及可能的作用机制。方法：用全骨髓贴壁法分离、纯化SD大鼠MSCs;用MTT法检测0、5、10、20、40、80和100 μg/L rhTGF-β1对MSCs增殖活性的影响;以碱性磷酸酶(ALP)活性及ALP染色阳性率确定rhTGF-β1的最佳促MSCs骨向分化浓度,并以该浓度对MSCs骨向分化进行干预。按是否添加经典成骨诱导液将实验分为：正常组、经典组、rhTGF-β1组和rhTGF-β1+经典组。通过检测ALP、I型胶原、骨钙素表达和钙化结节的数目,评价各组骨向分化能力;通过检测BMP-2、Smad4和Cbfa1 mRNA的表达,评价各组促MSCs骨向分化的可能作用机制。结果：rhTGF-β1最佳促MSCs增殖浓度为10 μg/L,最佳促MSCs骨向分化浓度为5 μg/L。经典组、rhTGF-β1组和rhTGF-β1+经典组均能促进MSCs骨向分化,刺激BMP-2分泌,并上调Smad4和Cbfa1 mRNA的表达,且rhTGF-β1对MSCs成骨分化的早期、中期效果好,而rhTGF-β1+经典组对MSCs成骨分化的晚期效果更为明显。结论:经典组、rhTGF-β1组和rhTGF-β1+经典组均有促MSCs骨向分化的作用,其机制可能是促进BMP-2的分泌,通过TGF-β超家族/Smads信号通路调控骨向分化。     

间歇牵拉应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

目的探讨体外间歇拉伸应变对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cell,rBMSC)的增殖与成骨分化效应。方法应用Flexcell-4 000应力系统,将间歇拉伸应变(振幅10%,频率0.5 Hz,每天作用2次,4 h/次)作用于体外分离培养的正常rBMSC,加力1、3、5、7 d后检测应力对细胞形态改变、细胞增殖及骨形成核心结合因子Cbfα1、碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原等成骨基因和Cbfα1蛋白的影响。结果 rBMSC在间歇牵拉应力作用1 d后即出现增殖速度减缓,一直延续到加力第7 d,ALP和I型胶原等成骨基因的表达自加力3 d后升高了3～6倍(P<0.05),并且Cbfα1的基因和蛋白表达在力学刺激下都出现上调。结论力学刺激在rBMSC的增殖与分化中起重要作用,适宜的间歇拉伸应变可以减缓BMSC的增殖,促进其成骨分化。     

人骨髓MSC对PHA活化T细胞周期以及表型和细胞因子分泌的影响

目的研究人骨髓间充质干细胞(MSC)对T细胞周期和活化的影响,探讨MSC对T细胞增殖抑制的作用机制。方法Ficoll密度梯度离心法分离纯化人骨髓MSC,体外扩增培养3代后用于实验。应用流式细胞术分析MSC对PHA作用下T细胞周期和早期表型CD25、CD69表达的影响,ELISA法检测细胞因子水平。结果人骨髓MSC体外可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期,下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达,抑制IL-2、IFN-r的分泌。结论人骨髓MSC体外可通过对T细胞周期的影响抑制其活化和增殖。     

干细胞若干定义的相关探讨

背景：近10年来干细胞研究所取得的巨大进展,不仅影响和促进了生物学及其相关基础科学,而且还在医学、药物开发、农业等许多领域得到广泛的应用,目前已成为研究的热点问题。 目的：在干细胞的定义上还存在一些需要探讨的问题,明确定义将有利于干细胞研究的快速发展。 方法：回顾干细胞的发展和概念提出,特别是通过中英文权威定义的比较,提出作者的看法。 结果与结论：干细胞的定义上还存在一些问题值得探讨,特别是一些中英文表述不同影响了理解。例如,“多能干细胞”对应译成两个单词：Pluripotent Stem Cell和Multipotent Stem Cell,然而Pluripotent和Multipotent两个单词的英文意义不同。为了学术交流和沟通,作者提出将Pluripotent Stem Cell称为“万能干细胞”,而保留Multipotent Stem Cell为“多能干细胞”的定义。以上结论供广大同仁探讨,以利于抛砖引玉。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的： 体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境，诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为造血干细胞（HSCs）。方法：将小鼠E14 ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体（EB），分别于3、6、9、12、15 d时收获EB，流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+ 细胞处于高峰期的EB细胞，在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化，并设无饲养层对照，分别于3、6、9、12 d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+ 细胞含量，并分析造血细胞集落形成能力。结果：诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9 d达峰值（27.53%± 2.84％），与未添加因子组（8.77%± 1.12％）比较差异显著(P<0.05)。将培养9 d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化，第6 d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值，分别为7.31%±1.21％、7.62%±1.52％，其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍，与无饲养层组比较显著差异（P<0.05）。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论：人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs，为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。     

人多能干细胞的冷冻与保存

背景：人多能干细胞的出现与发展是近年来生物医学研究领域的重大突破。但其在基础/临床研究中的广泛应用还有诸多限制,建立安全有效标准化的冷冻保存方案是人多能干细胞广泛应用面临的重大挑战。 目的：回顾人多能干细胞冷冻领域的研究进展,探索造成冷冻损伤的原因和机制及改进方式,致力于促进新的更有效的冷冻方案形成。 方法：以“人多能干细胞、人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞、玻璃化、程序化冷冻、慢冻法、冷冻保存”为中文检索词,以“human pluripotent stem cells,human embryonic stem cell,human introduced pluripotent stem cell,vitrification,programmed cryopreservation,slow-freezing,cryopreservation”为英文检索词,应用计算机检索中国知网全文数据库、万方全文数据库、维普(VIP)期刊全文数据库、PubMed数据库有关人多能干细胞冷冻保存技术的文献,排除与研究目的无关及重复文献,保留58篇文献进一步总结分析。 结果与结论：了解人多能干细胞冷冻过程中造成冷冻损伤的原因和机制,是寻找高效的冻存方案的关键。需要更清晰的了解冷冻过程中损伤的原理,改进和创新低温生物技术来避免各种冷冻损伤的发生并致力于探讨可重复的,高效的,符合GMP要求的,能大规模冻人多能干细胞的方案。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

体外分化胚胎干细胞为造血干细胞重建造血功能的研究

目的：探讨体外定向分化胚胎干细胞（ESCs）为造血干细胞（HSCs）对体内造血功能的重建作用。方法：将小鼠E14.1胚胎干细胞采用“三步诱导法”在体外分化发育为HSCs，造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况，免疫磁珠分选纯化HSCs移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性SCID小鼠，观察其植入及小鼠造血功能恢复情况。结果: 经过分阶段诱导，多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESCs定向分化发育为HSCs,流式细胞仪检测HSCs特异性表面标志物CD34+/Sca-1+表达最高为（58.64±4.20）%，CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落, Wright-Giemsa 染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSCs经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠，移植组小鼠+10 d造血功能开始恢复，观察40 d后除血小板恢复较慢外，白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常，植入率为71.4%，存活率为43.0%，染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论: 采用分阶段诱导的方法，可在体外定向诱导小鼠ESCs分化发育为HSCs，此来源的HSCs可以有效重建体内造血功能。     

肿瘤干细胞与胶质瘤细胞起源

经过过去20年的努力,癌基因和抑癌基因在神经胶质瘤形成及发展中的核心地位已达共识.然而,在生命科学研究突飞猛进、肿瘤诊断与治疗手段日新月异的今天,我们尚未确立这些核心分子在胶质瘤中作用的靶标,因此,胶质瘤的细胞起源-这一决定着人类最终克服胶质瘤的根本问题再度引起人类的关注.     

持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a(100 µg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34⁺/Sca-1⁺,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100 µg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典Wnt/β-catenin信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34⁺/Sca-1⁺细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

间充质干细胞调节树突状细胞相关功能的研究进展

树突状细胞(DCs)作为体内最强大的抗原提呈细胞,是适应性免疫应答的始动者,在较多疾病的发生发展过程中起着重要作用.间充质干细胞(MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞,由于其强大的自我修复、抑制炎症以及免疫调节作用已成为研究的热点.大量的研究表明MSCs能通过影响DCs的成熟及功能,达到缓解疾病的目的.通过对MSCs调节DCs功能调节的深入研究有望取得疾病治疗的新进展.     

放射状胶质细胞的研究进展

脊椎动物中枢神经系统(central neural system,CNS)发育过程中,有一类细胞与CNS的发育密切相关一神经干细胞(neural stem cells,NSCs),目前已知的NSCs主要有3种:神经上皮细胞、放射状胶质细胞(radial glial cells,RGCs)、基祖细胞.