下调垂体瘤转化基因对皮肤鳞状细胞癌细胞SCL-1细胞增殖及迁移能力的影响

目的 研究下调垂体瘤转化基因（PTTG）的表达对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞SCL-1细胞增殖及浸润转移能力的影响,探讨其相关的分子机制。方法 将SCL-1细胞分为三组（未处理组、转染对照siRNA组及转染PTTG siRNA组）,首先利用CCK-8试剂盒研究下调PTTG对SCL-1细胞增殖能力的影响,并利用Boyden chamber研究三组细胞的浸润转移能力,通过实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测MMP-2和MMP-9在三组细胞中的表达。结果 与未处理组和转染对照siRNA组相比,转染PTTG siRNA后能明显抑制SCL-1细胞增殖（P < 0.05）。此外,实时荧光定量PCR结果显示,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的表达均明显下降,表达水平分别是对照组的0.8%、23.2%和21.3%。Western印迹结果表明,转染PTTG siRNA后,PTTG、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平也明显下降（P < 0.05）。转染PTTG siRNA组的细胞穿膜数（51.38 ± 4.71）明显低于未处理组（131.33 ± 6.12）及转染siRNA对照组（127.72 ± 5.20）（P < 0.05）。结论 抑制PTTG的表达能显著抑制SCL-1细胞增殖及迁移,且可下调MMP-2和MMP-9表达。     

小干扰RNA沉默KIAA0101的表达对皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖和迁移的影响

目的 探讨KIAA0101蛋白表达下调对皮肤鳞状细胞癌（SCC）SCL-1细胞增殖和细胞侵袭能力影响的分子机制。方法 将KIAA0101 siRNA和对照siRNA分别转染SCL-1细胞,将SCL-1细胞分为3组：未转染组、对照siRNA组和KIAA0101 siRNA组。Western印迹检测3组细胞中KIAA0101蛋白的表达,CCK-8试剂检测细胞增殖,用Boyden小室检测细胞侵袭能力, Western印迹检测细胞增殖和细胞侵袭相关蛋白的表达。结果 KIAA0101 siRNA组中KIAA0101蛋白的相对表达量为0.062 ± 0.095,显著低于未转染组（0.359 ± 0.044）和对照siRNA组（0.379 ± 0.025）,P < 0.05,SCL-1细胞的增殖和侵袭能力亦降低（P < 0.05）。此外,与未转染组和siRNA对照组相比,KIAA0101 siRNA组中p21蛋白表达显著上升,而基质金属蛋白酶2表达显著下调（P < 0.05）。结论 KIAA0101表达下调介导的SCL-1细胞增殖抑制和侵袭能力降低与p21和基质金属蛋白酶2表达变化相关。 【关键词】 癌,鳞状细胞; 基因,KIAA0101; RNA,小分子干扰     

HDAC6siRNA对SCL-1细胞增殖和细胞凋亡的影响及分子机制

目的研究组蛋白去乙酰化酶6(histonedeacetylase6,HDAC6)siRNA对皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)SCL-1细胞增殖和凋亡的影响及分子机制。方法将SCL-1细胞分为三组:A为未处理组;B为siRNA对照组;C为HDAC6siRNA转染组。利用脂质体2000分别介导HDAC6siRNA和对照siRNA至SCL-1细胞中,利用Westernblot研究HDAC6siRNA对SCL-1细胞中HDAC6蛋白表达的影响。采用CCK-8试剂和流式细胞术分别研究HDAC6siRNA对SCL-1细胞增殖和细胞凋亡的影响,进一步利用WesternBlot技术分析细胞增殖相关蛋白P21和细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。结果 HDAC6siRNA转染组中HDAC6蛋白表达显著低于未处理组和siRNA对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与未处理组和siRNA对照组相比,HDAC6siRNA转染组中SCL-1细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)。HDAC6siRNA转染组中SCL-1细胞的早期凋亡率明显高于未处理组和siRNA对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。HDAC6siRNA转染组中Bcl-2表达明显下调,而P21和Bax表达显著上升。结论 HDAC6可能在皮肤鳞癌的发生发展中发挥重要作用,下调皮肤鳞癌中HDAC6的表达有望成为有用的分子治疗靶点。     

翻译控制肿瘤蛋白在鳞状细胞癌和细胞株A431及SCL-1中的表达

目的 探讨翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)在人皮肤鳞状细胞癌(SCC)组织及其细胞株A431及SCL-1中的表达,观察其对SCC细胞凋亡及增殖的影响.方法 免疫组化法观察TCTP蛋白在SCC组织中的表达.Western印迹法检测TCTP蛋白在SCC细胞株A431及SCL-1中的表达情况.继而构建针对编码TCTP的基因TPT1的siRNA序列,通过脂质体转染法转入A431细胞中,RT-PCR法检测TPT1的表达,Western印迹法检测TCTP蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法检测A431细胞增殖情况.结果 免疫组化结果显示,在SCC中存在着TCTP的高表达,且其表达水平与癌组织的分级有着正相关关系(P＜0.05).Western印迹结果证实,在A431细胞及SCL-1细胞株中都存在着TCTP的表达,以A431细胞表达为最高.荧光检测siRNA转染效率可达到90％ ～ 95％.RT-PCR及Western-Blot结果显示合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TPT1及TCTP的表达(P＜0.05).结论 合成的siRNA可以有效下调A431细胞中TP及TCTP的表达,这种下调可引起A431细胞凋亡率的上升和细胞增殖的抑制.     

垂体瘤转化基因小干扰RNA对人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤中基质金属蛋白酶2和9表达的影响

目的 探讨垂体瘤转化基因（PTTG）小干扰RNA（siRNA）对人皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）裸鼠移植瘤生长及浸润和转移相关因子基质金属蛋白酶（MMP）2、9表达的影响。方法 应用人皮肤鳞癌细胞株SCL-1细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察经PTTG siRNA治疗后移植瘤的生长情况,并利用RT-PCR和Western印迹检测PTTG siRNA治疗后PTTG、MMP-2及MMP-9 mRNA和蛋白的表达。结果 成功建立人皮肤鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,PTTG siRNA治疗能明显抑制瘤体的生长（P < 0.05）,并下调PTTG mRNA和蛋白的表达。此外,PTTG siRNA治疗组中其MMP-2和MMP-9的表达均明显下调。结论 PTTG siRNA能抑制人皮肤鳞癌裸鼠移植瘤的生长,并下调MMP-2和MMP-9表达。     

生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

目的 探讨生存素小分子干扰RNA（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法 培养的A431细胞分为3组：生存素siRNA组、阴性对照组和空白对照组,分别用50.0 nmol/L脂质体包裹的生存素基因序列特异性siRNA、无关序列siRNA阴性脂质体及预制囊泡转染。实时定量反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）、Western印迹法分别检测A431细胞生存素mRNA及蛋白的表达。采用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭双染法检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭力,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 转染后48 h,生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞中生存素mRNA水平分别为0.56 ± 0.15、0.88 ± 0.37、0.90 ± 0.43,蛋白表达水平分别为0.59 ± 0.04、0.86 ± 0.05、0.91 ± 0.07,差异均有统计学意义（F = 276.67、243.61,均P < 0.001）,且生存素siRNA组生存素mRNA和蛋白表达水平均显著低于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（均P > 0.05）。重复测量方差分析显示,转染生存素siRNA能抑制A431细胞增殖（F = 13.19,P = 0.004）,且生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后24 h, 3组间A431细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 83.97,P = 0.002）,且生存素siRNA组A431细胞凋亡率显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。转染后48 h,生存素siRNA组G2/M期细胞比例显著高于阴性对照组（P < 0.05）和空白对照组（P < 0.05）,而生存素siRNA组A431细胞迁移数及侵袭数均显著低于空白对照组（均P < 0.05）和阴性对照组（均P < 0.05）。结论 生存素序列特异性siRNA能抑制A431细胞生存素基因表达和细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,提示生存素可成为皮肤鳞状细胞癌基因治疗的靶点。     

靶向生存素的小干扰RNA抑制人黑素瘤M14细胞系生长的研究

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）对人黑素瘤M14细胞系生存素基因表达的抑制作用及对细胞凋亡、增殖和侵袭的影响。方法 构建靶向生存素的siRNA表达质粒,用脂质体法转染M14人黑素瘤细胞。RT-PCR检测M14细胞生存素mRNA的表达,Western印迹检测生存素蛋白的表达,流式细胞仪检测AnexinV标记的凋亡细胞,噻唑蓝（MTT）法分析细胞增殖,Transwell法分析侵袭能力。结果 与M14细胞和转染空载体的M14细胞比较,转染siRNA的表达质粒可以明显抑制生存素基因在转录和翻译上的表达。M14组和空载体组几乎无凋亡细胞,siRNA表达质粒组的凋亡率明显增加（χ2 ＝ 31.55,P < 0.01）。细胞增殖抑制率（63.6% ± 1.6%）也明显增加,同时Transwell细胞侵袭实验显示,siRNA表达质粒转染组抑制作用显著。结论 靶向生存素的siRNA表达质粒可以特异性抑制生存素的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖和侵袭并诱导细胞凋亡。     

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达抑制对A431细胞增殖和细胞周期的影响

目的研究葡萄糖?6?磷酸脱氢酶（G6PD）表达下调对皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）细胞增殖和细胞周期的影响。方法正常培养人永生化上皮细胞HaCaT、皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞,采用Western印迹法检测细胞中G6PD蛋白的表达。当A431细胞生长至85%~90%融合时,将siRNA对照（siRNA对照组）和G6PD siRNA（G6PD siRNA组）分别转染A431细胞,未转染的A431细胞则为未转染组。Western印迹法检测3组不同处理的A431细胞中G6PD蛋白及细胞周期蛋白D1、CDK4的表达,CCK?8法检测3组A431细胞的增殖情况,流式细胞仪分析3组A431细胞周期的变化。结果正常培养的2株皮肤鳞癌SCL?1和A431细胞中G6PD蛋白的表达水平（分别为0.308±0.023和0.643±0.046）均显著高于HaCaT细胞（0.100±0.019）,且A431细胞显著高于SCL?1细胞（均P<0.05）。A431细胞G6PD siRNA组G6PD、细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白的表达（0.134±0.027、0.154±0.017、0.166±0.017）显著低于未转染组（0.425±0.029、0.344±0.024、0.330±0.020）和siRNA对照组（0.444±0.033、0.350±0.027、0.348±0.018）,差异均有统计学意义（P<0.05）。G6PD siRNA组在24~96 h各时间点的细胞增殖活性均明显低于siRNA对照组和未转染组（P<0.001）,而siRNA对照组与未转染组间细胞增殖差异无统计学意义（均P>0.05）。G6PD siRNA组G0/G1期A431细胞比例显著高于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）,而G6PD siRNA组S期A431细胞比例又显著低于siRNA对照组及未转染组（P<0.001）。结论G6PD可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖和细胞周期中发挥重要作用。     

lncRNA LEF1-AS1通过靶向miR-612调控皮肤鳞状细胞癌细胞株增殖、凋亡、迁移侵袭的体外实验研究

【摘要】 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）LEF1-AS1对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法 通过干扰皮肤鳞状细胞癌SCC13细胞LEF1-AS1的表达和过表达、抑制miR-612的表达，将SCC13细胞分为转染LEF1-AS1干扰序列、无义序列的干扰LEF1-AS1组、干扰对照组，转染miR-612过表达序列、无义序列的miR-612过表达组、过表达对照组，以及转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制序列的干扰抑制组，和转染LEF1-AS1干扰序列与miR-612抑制无义序列的干扰抑制对照组。采用qRT-PCR法检测各组细胞miR-612的相对表达，CCK8法检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞的凋亡情况，Transwell试验检测细胞的迁移、侵袭能力，Western印迹检测细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂（p21）、Bcl-2家族蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达。用LncBase Predicted v.2 在线预测网站预测lncRNA LEF1-AS1与miR-612之间的互补序列，将互补/非互补序列用于构建荧光素酶报告基因质粒，分别与miR-612过表达及过表达对照基因共转染SCC13细胞，验证lncRNA LEF1-AS1与miR-612的结合能力。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。结果 miR-612过表达组细胞增殖能力、迁移及侵袭细胞数均低于过表达对照组（均P < 0.05），凋亡率高于过表达对照组（P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组、干扰对照组、干扰抑制组、干扰抑制对照组miR-612的相对表达差异有统计学意义（F = 150.78，P < 0.001），24、48、72 h时的增殖能力差异有统计学意义（均P < 0.05），凋亡率、迁移及侵袭细胞数差异均有统计学意义（均P < 0.05）。干扰LEF1-AS1组细胞中miR-612表达、凋亡率高于干扰对照组，48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数低于干扰对照组（均P < 0.05），而干扰抑制组细胞中miR-612表达、细胞凋亡率低于干扰抑制对照组，48、72 h细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数高于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。Western印迹显示，4组细胞cyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P < 0.001），干扰LEF1-AS1组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰对照组，p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰对照组（均P < 0.05）；而干扰抑制组cyclinD1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白相对水平均高于干扰抑制对照组，p21、 Bax蛋白相对水平低于干扰抑制对照组（均P < 0.05）。共转染互补序列后，miR-612过表达组细胞荧光活性低于过表达对照组（t = 21.19，P < 0.001）；而共转染非互补序列后，miR-612组细胞荧光活性与过表达对照组差异无统计学意义（t = 0.28，P = 0.78）。结论 lncRNA LEF1-AS1调控皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，机制与靶向miR-612相关。     

皮肤肿瘤

20130926RNA干扰神经突起导向因子Netrin-1表达下调对鳞状细胞癌SCL-1细胞的影响/庞霞(郑州大学第一医院病理科),董斌,李晟…∥中华皮肤科杂志.-2012,45(11).-803～805应用脂质体2000将Netrin-1 siRNA和对照siRNA转染皮肤鳞癌SCL-1细胞,并将细胞分为对照1组(未处理组)、对照2组(siRNA对照组)、实验组(Netrin-1     

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）沉默肾上腺髓质素（ADM）基因对黑素瘤细胞系A375增殖和凋亡的影响。方法 实时荧光定量-PCR（qRT-PCR）检测干扰效果,并选出干扰效果最好的siRNA。用筛选出的最有效siRNA转染A375细胞为实验组;转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组。免疫细胞化学法蛋白水平检测干扰效果;噻唑蓝法（MTT）分别测定沉默ADM基因 24、48 h后A375细胞增殖的变化;流式细胞仪（FCM）检测干扰ADM基因48 h后A375细胞的凋亡情况。结果 qRT-PCR显示ADM-siRNA-2干扰效果最好。免疫细胞化学结果显示转染ADM-siRNA-2后ADM蛋白的表达显著低于未转染组和阴性对照组。MTT结果显示,转染ADM-siRNA-2的细胞24、48 h吸光度A值为0.389 ± 0.0375,0.469 ± 0.0330,低于空白对照组 （ 0.574 ± 0.0733、0.685 ± 0.0154）和阴性对照组（0.548 ± 0.0376、0.676 ± 0.0374）,差异均有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。FCM检测显示转染ADM-siRNA-2组的细胞早期凋亡率为（20.200 ± 6.046）%,高于空白对照组（1.667 ± 0.340）%和阴性对照组（4.587 ± 1.294）%,差异有统计学意义（P值均 < 0.05）,空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义（P值均 ＞ 0.05）。结论 siRNA沉默ADM基因对A375增殖有抑制作用;而对凋亡则有明显促进作用。     

短发夹RNA干扰STAT3基因对恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 研究短发夹RNA（shRNA）沉默STAT3基因表达对人恶性黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的作用。 方法 设计和构建靶向STAT3基因有小发夹结构的正义和反义寡核苷酸,退火后克隆入psiRNA-hH1neo质粒,使用脂质体转染A375。实验分为对照组、空载体组和STAT3转染组。通过RT-PCR和Western印迹检测A375细胞中STAT3 基因mRNA和蛋白表达水平,MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布,观察细胞凋亡。结果 STAT3转染组A375细胞STAT3 mRNA和蛋白表达水平（分别为0.2136 ± 0.0626、0.8214 ± 0.0430）明显低于对照组（0.7826 ± 0.0701、3.1693 ± 0.0846）和空载体组（0.8518 ± 0.0783、3.2180 ± 0.0780）,P值均 < 0.01。STAT3转染24、48、72 h组的细胞增殖抑制率明显增高（分别为21.35% ± 2.12%、32.52% ± 2.64%、40.40% ± 3.08%）,与正常对照组（1.39% ± 0.53%、3.05% ± 1.16%、4.41% ± 1.42%）、空载体组（2.63% ± 1.38%、5.84% ± 2.47%、10.32% ± 2.48%）比较,差异均有统计学意义（P < 0.01）。流式细胞仪检测显示,STAT3转染组细胞的凋亡率（81.06% ± 2.10%）较对照组（26.28% ± 0.47%）和空载体组（27.31% ± 1.05%）明显增高,差异有统计学意义（P < 0.01）。细胞周期分析显示,STAT3转染组G0 / G1期细胞比例（68.43% ± 4.00%）增高,S期细胞比例（17.40% ± 2.05%）降低,与对照组（分别为60.07% ± 2.47%、28.40% ± 2.09%）及空载体组（分别为60.29% ± 2.26%、27.34% ± 3.63%）相比,差异有统计学意义（P < 0.01或 < 0.05）。结论 针对STAT3基因的特异性小RNA干扰质粒能够下调STAT3 基因和蛋白表达,抑制A375的增殖能力,诱导细胞凋亡。     

miR-145对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的 研究miR-145对人角质形成细胞系HaCaT细胞增殖、细胞周期及凋亡的调控效应。 方法化学合成miR-145的模拟物,采用瞬时转染的方法过表达miR-145。采用实时PCR方法检测miR-145的表达。MTS方法检测过表达miR-145对HaCaT细胞增殖的影响。流式细胞仪分析过表达miR-145对细胞周期及凋亡的影响。采用荧光素酶实验,实时PCR和Western印迹鉴定NRAS是否为miR-145的靶基因。 结果 与阴性对照（NC）mimics转染组相比,miR-145 mimics转染组miR-145表达水平上调（85.00 ± 1.21）倍,两组差异有统计学意义（t = 115.90,P < 0.001）。转染miR-145 mimics有抑制HaCaT细胞的增殖作用（F = 8.76,P = 0.008）;转染后的时间因素（24、48、72、96 h）对细胞有影响（F = 17.85,P < 0.001）,转染mimics和培养时间之间不存在交互作用（F = 1.21,P = 0.18）。与NC mimics转染组相比,miR-145 mimics转染组的早期凋亡、晚期凋亡细胞比例均明显增加,差异有统计学意义（18.9% ± 4.1%比4.3% ± 1.2%,t = 7.126,P < 0.01;9.3% ± 2.3%比3.6% ± 1.6%,t = 12.38,P < 0.01）。与NC mimics转染组相比,miR-145 mimics转染组HaCaT细胞的G2及S期细胞比例均明显降低,差异均有统计学意义（6.26% ± 1.2%比19.36% ± 3.45%,t =7.610,P = 0.017;7.91% ± 1.3%比18.56% ± 5.23%,t = 7.230,P = 0.019）,而处于G1期的细胞比例升高,差异也有统计学意义（85.83% ± 5.2%比62.08% ± 6.23%,t = 11.78,P = 0.007）。与NC mimics联合psi-CHECK2-NRAS-wild组相比,在293T细胞中共转染miR-145 mimics和psi-CHECK2-NRAS-wild质粒,其荧光素酶值明显下降,miR-145可抑制含NRAS mRNA 3′UTR报告基因的荧光素酶表达（t = 11.09,P = 0.008）;而将NRAS mRNA 3′UTR报告基因上miR-145的结合位点进行突变后,转染miR-145 mimics对含NRAS mRNA 3′UTR报告基因的荧光素酶表达无明显的影响（P > 0.05）。实时PCR和Western印迹结果表明,过表达miR-145 mimics后,NRAS mRNA表达水平未出现明显变化（P > 0.05）,对NRAS蛋白水平的表达有明显的抑制（1.52 ± 0.07比0.20 ± 0.02,t = 28.43,P < 0.01）。 结论 miR-145可能通过NRAS影响HaCaT细胞的周期从而抑制细胞的增殖,同时促进HaCaT细胞的凋亡。     

氨基酮戊酸光动力疗法对鳞状细胞癌细胞株A431蛋白激酶D1及其磷酸化位点的影响

目的 研究氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对皮肤鳞状细胞癌A431细胞蛋白激酶D1（PKD1）的影响,探讨ALA-PDT诱导A431细胞凋亡的机制。方法 体外培养A431细胞,用CCK-8法检测筛选出抑制作用最强的ALA浓度和光动力照射（PDT）剂量组合。将对数期生长A431细胞随机分为不予任何干预的对照组、ALA组、PDT组及ALA-PDT组,观察4组细胞接受相应干预12、24、36、48 h后细胞增殖抑制率和增殖抑制作用最强时间点的凋亡率。反转录PCR检测ALA-PDT作用A431细胞不同时间点后各组PKD1基因mRNA的表达。Western 印迹法检测各组A431细胞中PKD1及其磷酸化位点Tyr463蛋白（pTyr463）、Ser916蛋白（pSer916）表达。结果 ALA浓度1.5 mmol/L、光照剂量2 J/cm2为最佳剂量组合。4组细胞干预12、24、36、48 h的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 39.56,P < 0.05）。孵育24 h时：ALA-PDT组细胞增殖抑制率（46.26% ± 1.25%）高于ALA组（14.65% ± 0.33%）、PDT组（14.96% ± 0.68%）和对照组（11.98% ± 0.32%）,差异有统计学意义（均P < 0.05 ）;ALA-PDT组细胞增殖抑制率高于12 h（P < 0.05）;4组细胞凋亡率差异有统计学意义（F = 16.32,P < 0.05）,ALA-PDT组（41.92% ± 3.23%）高于对照组（4.67% ± 0.88%）、ALA组（7.02% ± 1.52%）和PDT组（8.37% ± 0.59%）,均P < 0.05。ALA-PDT作用于A431细胞后0、6、12、24、36、48 h,细胞PKD1基因mRNA的相对表达量差异有统计学意义（F = 22.24,P < 0.05）,孵育24 h mRNA相对表达量低于0、6、12 h（均P < 0.05）,与36、48 h差异无统计学意义（均P > 0.05）。4组A431细胞中pSer916表达量差异无统计学意义（F = 1.53,P > 0.05）,PKD1和pTyr463表达量差异有统计学意义（F值为10.04、8.27,均P < 0.05）,ALA-PDT组PKD1、pTyr463的表达低于对照组、ALA组、PDT组（均P < 0.05）。结论 PKD1可能参与ALA-PDT疗法诱导A431细胞凋亡的光化学反应进程,且可能是通过Tyr463位点活化促进癌变的发展。     

RNA干扰趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤M14细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨靶向沉默趋化因子受体CXCR7基因对黑素瘤细胞株M14侵袭和迁移能力的影响。方法 采用Western印迹实验检测黑素瘤M14和A375细胞CXCR7蛋白的表达,选取高表达CXCR7蛋白的M14细胞作为研究对象。将M14细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组：实验组转染CXCR7-siRNA,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做任何处理。采用实时定量PCR和蛋白质印迹法分别检测CXCR7 mRNA和蛋白在M14细胞中的表达水平, Transwell小室法及细胞划痕法检测干扰前后细胞侵袭及迁移能力的变化。 结果 实验组M14细胞CXCR7 mRNA及蛋白相对表达量分别为0.412 ± 0.023、0.144 ± 0.005,明显低于阴性对照组（1.211 ± 0.117、1）以及空白对照组（1.000 ± 0.102、1.016 ± 0.004）,差异均有统计学意义（F值分别为30.068、11 485.5,P值分别为0.001、0.000）。实验组M14细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数为（20.617 ± 1.503）个,明显少于阴性转染对照组［（42.000 ± 6.018）个］和空白对照组［（43.627 ± 2.152）个］,3组间比较差异有统计学意义（F = 32.416,P = 0.001）。划痕实验中,实验组每高倍视野（× 200）下细胞迁移数为15.00 ± 1.10,明显少于阴性对照组（44.90 ± 2.20）和空白对照组（45.30 ± 2.30）,3组间比较差异有统计学意义（F = 2 411.945,P = 0.000）。 结论 靶向沉默CXCR7能显著抑制黑素瘤M14细胞的侵袭和迁移,有望为皮肤黑素瘤提供潜在的治疗靶点。     

喜树碱对HaCaT细胞低氧诱导因子1α表达的影响

目的 观察喜树碱对低氧（2% O2）培养下HaCaT细胞低氧诱导因子1α（HIF-1α）表达的影响,探讨外用喜树碱治疗银屑病可能的作用机制。 方法 将HaCaT细胞分为实验组和溶媒组（对照组）,实验组为喜树碱 + DMEM培养液,终浓度分别为12.5、25、50、100、200 nmol/L;溶媒组为含二甲基亚砜（DMSO）的DMEM培养液。不同浓度的喜树碱作用于HaCaT细胞12、24、48、72 h,CCK8法检测细胞增殖;用以上浓度处理低氧诱导12 h的HaCaT细胞,Western印迹检测细胞HIF-1α蛋白的表达。将HaCaT细胞分为常氧组和低氧组,每组内再分喜树碱干预组（100 nmol/L）和非干预组（溶媒对照组）,培养12 h后实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA的相对表达。统计分析采用SPSS16.0软件进行Levene′s test、单因素方差分析、Dunnett-t检验和析因分析。结果 不同浓度喜树碱作用12、24、48、72 h后对HaCaT细胞的增殖有抑制作用,呈浓度和时间依赖关系;200 nmol/L喜树碱作用12 h,100、200 nmol/L喜树碱作用24 h细胞增殖抑制率分别为（17.66 ± 6.46）%、（33.11 ± 4.63）%、（56.31 ± 1.69）%,与同时段溶媒对照组间差异有统计学意义（均P < 0.05）。低氧诱导12 h,25、50、100、200 nmol/L 喜树碱处理后HIF-1α蛋白表达分别为0.348 ± 0.065、0.261 ± 0.112、0.115 ± 0.043、0.045 ± 0.024,与溶媒组（1.445 ± 0.329）比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）。喜树碱干预（100 nmol/L）与非干预的HIF-1α mRNA表达（△Ct值）分别为：常氧组-5.575 ± 0.29、-5.451 ± 0.21;低氧组-6.543 ± 0.57、-6.203 ± 0.31;低氧较常氧条件下HaCaT细胞HIF-1α mRNA的表达下调,差异有统计学意义（F = 29.856,P < 0.05）;喜树碱干预和非干预组间HaCaT细胞HIF-1α mRNA的表达在常氧和低氧条件下差异无统计学意义（F = 1.667,P > 0.05）。结论 100 nmol/L喜树碱可抑制HaCaT细胞HIF-1α蛋白表达,对HIF-1α mRNA的表达水平无明显影响。     

Nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响及可能机制

目的 观察顺式咪唑啉衍生物nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响,研究其机制。 方法 将A375细胞分为实验组和对照组,实验组细胞接受2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理,对照组细胞采用二甲基亚砜处理。分别于作用24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况;Western印迹检测p53蛋白表达的改变;流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡;Transwell法检测迁移性变化。采用重复测量的方差分析进行统计学检验。 结果 2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理A375细胞24、48、72 h后,MTT法显示不同时间点间的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 67.43,P < 0.01）,不同浓度间的抑制率差异有统计学意义（F = 135.58,P < 0.01）,浓度越高抑制率越高;时间和浓度之间有交互作用（F = 26.95,P < 0.01）。Western印迹 、流式细胞仪、Transwell法检测显示,不同时间点之间A375细胞的p53表达、G2期细胞百分率、凋亡率、迁移抑制率差异均有统计学意义（F值分别为1255.00、831.38、809.45、1100.00,均P < 0.01）,除p53外,时间越长各项指标值越高;不同浓度间各项指标值差异均有统计学意义（F值分别为9196.00、267.99、723.83、1667.00,均P < 0.01）,浓度越高各项指标值越高;时间与浓度之间交互作用有统计学意义（F值分别为826.79、21.602、44.48、313.09,均P < 0.01）。 结论 nutlin-3可能通过p53蛋白积累途径抑制人A375细胞的增殖和迁移,促进细胞周期停滞和细胞凋亡。