慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响

目的:研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响. 方法:构建含bcr/abl RNAi序列的pNL-B/A-EGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆(B/A-K562).Real-time PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AO-EB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase-3、Caspase-9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFP-K562作对照. 结果:成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/A-K562细胞, Real-time PCR及Western blotting证实B/A-K562细胞中bcr/abl mRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调.bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长(37.1 vs 20.4、23.3 h)、集落形成能力减弱(P<0.01),K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降(P<0.01),自发凋亡率显著提高(P<0.01),细胞中Caspase-3(P<0.05)及Caspase-9(P<0.01)活性明显提高.结论:慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡.     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

慢病毒介导shRNA特异性沉默livin基因促进SPC-A1细胞凋亡

目的：建立慢病毒介导的livin基因沉默系统,探讨其对肺癌细胞凋亡的影响。方法：Livin shRNA慢病毒感染肺腺癌细胞株SPCA1沉默livin基因表达。应用PI染色经荧光镜下观察SPCA1细胞凋亡形态,流式细胞术检测SPCA1细胞凋亡率及亚二倍体峰形成,Realtime PCR及Western blotting方法检测livin和caspase 3表达的改变。结果：livin基因在肺腺癌细胞株SPCA1中持续高表达。经慢病毒介导shRNA使livin基因表达沉默后,镜下可见肺腺癌细胞出现典型凋亡形态特征,流式细胞术检测出现亚二倍体峰,细胞凋亡率较空白对照及阴性病毒对照细胞明显增加（8.21％ vs 0.08％, 0.13％;P<0.05）,RTPCR及Western blotting 检测结果显示,caspase 3 mRNA表达无改变,但cleavedcaspase 3蛋白表达上调。结论：慢病毒载体介导的shRNA能抑制肺腺癌细胞株SPCA1中livin基因的表达,从而促进SPCA1细胞凋亡。     

慢病毒介导bcr/abl基因RNAi对白血病K562细胞生物学特性的影响

目的: 研究慢病毒介导RNAi致bcr/abl基因长期沉默对K562白血病细胞各种生物学特性的影响。方法：构建含bcr/abl RNAi序列的pNLB/AEGFP慢病毒重组质粒载体并包装病毒,感染K562细胞,挑取稳定转化的克隆（B/AK562）。Realtime PCR及Western blotting验证干扰效应;锥虫蓝染色、集落形成实验检测细胞增殖能力变化;联苯胺染色观察细胞分化;ELISA法检测酪氨酸激酶活性;AOEB染色观察细胞凋亡;比色法检测Caspase3、Caspase9活性;以上检测均以K562细胞和转染空质粒EGFPK562作对照。结果：成功构建bcr/abl基因RNAi稳定转染的B/AK562细胞, Realtime PCR及Western blotting证实B/AK562细胞中bcr/abl mRNA及P210bcr/abl蛋白含量明显下调。bcr/abl基因稳定下调后,K562细胞倍增时间明显延长（37.1 vs 20.4、23.3 h）、集落形成能力减弱（P<0.01）,K562细胞向红系分化,酪氨酸激酶活性下降（P<0.01）,自发凋亡率显著提高（P<0.01）,细胞中Caspase3（P<0.05）及Caspase9（P<0.01）活性明显提高。结论：慢病毒介导的RNAi能实现bcr/abl基因长期沉默,从而抑制K562细胞恶性增殖,诱导其分化及凋亡。     

siRNA沉默 CDX2 基因联合化疗药物对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨siRNA靶向沉默CDX2基因联合长春新碱(vincristine,VCR)对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响.方法:设计靶向沉默CDX2基因表达的特异性siRNA序列CDX2-siRNA-921和相应的阴性对照序列CDX2-siRNA-NC,分别转染K562细胞,同时设正常细胞组做对照.分别应用Real-time PCR和Western blotting法检测转染CDX2-siRNA-921对细胞内CDX2、BCR-ABL mRNA和蛋白表达的影响;siRNA和VCR单独或联合作用于K562细胞后,应用MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖抑制率、凋亡率的变化.结果:与正常细胞组相比,CDX2-siRNA-921能够显著降低目的基因CDX2和BCR-ABL mRNA与蛋白的表达(均P＜0.05),而CDX2-siRNA-NC组CDX2和BCR-ABL mRNA与蛋白表达量无明显变化;与VCR组、CDX2-siRNA-NC组和VCR+ CDX2-siRNA-NC组相比,VCR+ CDX2-siRNA-921组细胞增殖抑制率降低,凋亡率明显增加(均P＜0.05).结论:CDX2-siRN-921能显著降低K562细胞内CDX2 mRNA和蛋白的表达,并能够下调BCR-ABL融合基因表达水平,同时增强VCR对K562细胞增殖抑制、凋亡诱导作用.     

反义ras基因增强足叶乙甙对白血病K562细胞的诱导凋亡作用

目的 研究ras p21蛋白在bcr-abl p210蛋白抗凋亡信号传导通路中的作用。方法 应用逆转录病毒载体pLXSN将反义N－ras1 cDNA转导到K562细胞系中后，通过足叶乙甙对细胞进行诱导凋亡。结果 转导反义N－ras1 cDNA的K562细胞内N－ras p21表达下降。反义N－ras转民细胞较对照细胞K562易发生凋亡，对药物的敏感性显著增高。结论 ras p21蛋白是bcr-abl p210蛋白介导抗凋亡信号的重要的下游蛋白，阻断该蛋白的功能有可能成为治疗人类慢性髓性白血病的1个选择点。     

靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体对U937细胞增殖与凋亡影响观察

目的：观察慢病毒介导的短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）沉默同源盒A9（homeoboxA9,HOXA9）基因对U937细胞增殖和凋亡的影响。方法：前期从4条针对HOXA9基因的RNA干扰（RNAinterference,RNAi）慢病毒载体中筛选出了l条敲减效率最高的包装成慢病毒H0xA9／GVll8RNAi—LV#2。实验分为对照组（control,CON）、阴性对照组（negativecontrol,NC）及敲减组（knockdown,KD）。HOXA9／GVll8RNAi-LV#2感染U937细胞5d后,FCM检测U937细胞感染效率,应用实时荧光定量PCR法检测HOXA9mRNA的沉默效率,蛋白质印迹法检测HOXA9蛋白的表达;MTT法和绘制细胞生长曲线检测细胞增殖抑制情况;FCM检测细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR法检测细胞c-mycmRNA及p27mRNA表达情况。结果：慢病毒感染效率〉90％,KD组细胞中HOXA9mRNA的沉默效率〉55％,HOXA9蛋白的表达量明显减少,其中KD组相对表达水平达（0．223±0．024）,显著低于NC组（0．884±0．009）及CON组（0．891±0．013）,差异有统计学意义,F=1566．202,P〈0．001。MTT结果显示,KD组细胞的IR值为（40．469±1．756）％,明显高于NC组及CON组（F=1311．928,P〈0．001）,细胞生长曲线表明该组细胞生长速度减慢;FCM结果显示,KD组、NC组及CON组凋亡率分别为（26．762±2．245）％、（6．819±0．547）％和（6．113±0．349）％,KD组与NC组（q=25．501,P〈0．001）及CON组（q=26．418,P〈0．001）比较差异均有统计学意义,提示该载体显著增加细胞凋亡率;其细胞周期G0／G1期细胞比例较CON组及NC组明显增加,提示该载体使细胞周期阻滞于G0／G1期,F=27．769,P=0．001;RT-PCR结果表明,U937细胞KD组较CON组及NC组c-mycmRNA表达水平下降,p27mR—NA表达水平上升。结论：靶向HOXA9基因shRNA慢病毒载体能稳定沉默HOXA9表达,可显著抑制U937细胞增殖并促进其凋亡,同时可下调c-myc表达,上调p27表达,使细胞周期阻滞于G0／G1期。     

端粒酶RNA反义寡核苷酸对白血病细胞K562增殖的影响

目的：探讨人类端粒酶RNA的反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响。方法：采用MTT和试验和平板集落形成实验观察反义寡核苷酸作用后K562细胞的生长情况，采用流式细胞仪分析细胞周期的改变，采用电镜观察细胞超微结构的改变，用PCR－ELISA分析细胞端粒酶活性的改变。结果：端粒酶RNA的反义寡核苷酸作用K562细胞后，细胞超微结构和细胞周期发生明显改变。端粒酶活生到明显抑制，细胞增殖受到明显抑制。结论：靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸抑制白血病细胞K562的增殖。     

超声体外诱导白血病细胞K562凋亡的研究

 目的 研究超声对诱导白血病细胞K562凋亡的作用,为超声治疗的临床应用提供实验依据。方法 以人慢性粒细胞白血病急变细胞株K562为研究对象,用频率为1.8 MHz的超声波辐照白血病细胞K562,用光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 超声辐照K562细胞后24 h,8 mV×5 min组及8 mV×10 min组细胞凋亡率分别为2.3 %和8.28 %;10 mV×5 min及10 mV×10 min组细胞凋亡率分别为9.36 %和21.46 %。电压为7mV时,超声辐照K562细胞后0.5 h,1 h,3 h,5 h细胞凋亡率分别为1.9 %,3.6 %,5.7 %,7.7 %。同时光学显微镜下可见凋亡小体形成等典型形态学改变。结论 超声可以诱导白血病K562细胞凋亡。     

紫草素诱导人白血病细胞K562的凋亡

目的: 研究紫草素对人白血病细胞株K562增殖抑制和诱导凋亡作用.方法: 四氮甲唑蓝(MTT)观察细胞的生长状况,应用彗星分析法、TUNEL技术和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果: 紫草素在(1-9)×10-5mol/L浓度范围内能明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性,9 X 10-5mol/L紫草素作用72h的K562细胞株A值最低;彗星分析法显示经紫草素作用的K562细胞出现长的彗尾条带;原位细胞凋亡可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块;流式细胞仪检测细胞凋亡主要发生在G1/S期.结论: 紫草素在体外一定浓度范围内能抑制K562细胞增殖,诱导凋亡.     

科罗索酸对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响

目的:探究科罗索酸（corosolic acid）对白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法:使用不同浓度的科罗索酸处理K562细胞,CCK-8法检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响,分光光度法检测对Caspase-3/7,-8,-9活性的影响。结果:科罗索酸能显著抑制白血病K562细胞的增殖,并且这种抑制作用随着科罗索酸浓度升高和培养时间延长而显著增强。科罗索酸处理后的K562细胞中,处于G0/G1期的细胞比率明显升高（P＜0.05）,S期和G2/M期的细胞明显减少（P＜0.05）,凋亡细胞明显增多（P＜0.05）,Caspase-3/7,-8和-9的活性明显增强。结论:科罗索酸能抑制白血病K562细胞的增殖,促进其凋亡,这一效应可能与Caspase活性的增强有关。     

PI3K/Akt抑制剂渥曼青霉素对白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究PI3K/Akt抑制剂渥曼青霉素对白血病细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法: 以不同浓度的渥曼青霉素作用于人类髓细胞白血病细胞K562,采用MTT法检测细胞增殖活性,单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA损伤形成的“彗星”样拖尾现象,Annexin VFITC/PI双标法检测细胞凋亡,Western blotting、RTPCR检测渥曼青霉素作用K562细胞后总Akt和磷酸化Akt以及NFκB基因及蛋白表达水平的变化。结果: 渥曼青霉素以时间剂量依赖性方式抑制K562细胞的增殖,其24 h的IC50是25 nmol/L。渥曼青霉素诱导K562细胞发生凋亡,其作用呈明显剂量依赖性增强。渥曼青霉素作用后K562细胞DNA链断裂,呈现“彗星”拖尾现象,其尾长与拖尾率显著高于对照组(P<0.01)。渥曼青霉素能同时在蛋白和基因水平,以剂量依赖性方式抑制磷酸化Akt以及NFκB表达,但对总Akt蛋白没有明显影响。结论: 渥曼青霉素以时间和剂量依赖方式明显抑制K562细胞的增殖及诱导其凋亡,其机制可能与其下调磷酸化PI3K/Akt信号通路以及NFκB蛋白表达有关。     

紫杉醇对K562细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用

目的　探讨紫杉醇体外抑制 K5 6 2细胞株及诱导凋亡的作用。方法　体外培养 K 5 6 2白血病细胞株 ,以不同浓度紫杉醇处理 12～ 72小时后 ,用 MTT法测定细胞生长抑制作用 ,用细胞形态学观察和 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 ,用流式细胞仪 (FCM)检测细胞 DNA含量及细胞周期。结果　 K5 6 2细胞经紫杉醇处理后细胞生长受抑 ,对 K5 6 2细胞的半数抑制浓度 IC50 为 0 .84μg/ ml。经药物作用后可见细胞染色质浓聚和凋亡小体形成 ,FCM显示细胞凋亡率明显增加 ,但电泳检测未见 DNA裂解。结论　紫杉醇能抑制 K5 6 2细胞的生长 ,诱导细胞凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一     

野生型p53基因蛋白在氨肽酶抑制剂诱导人白血病细胞株K562细胞凋亡的实验研究

目的研究野生型p53基因蛋白对国产氨肽酶抑制剂乌苯美司(ubenimex)诱导人白血病细胞凋亡的影响及其作用机制。方法真核转导试剂FuGEMNE^TM6转导入K562细胞，免疫组化法检测细胞p53蛋白的表达，DNA片段原位末端标记及流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡，Rhodamin(Rh)123染色后，FCM检测细胞线粒体跨膜电位。结果p53基因cDNA转导的细胞p53蛋白表达增加；p53基因转导能促进ubenimex诱导K562细胞凋亡并增加ubenimex诱导的K562细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的下降。结论野生型p53基因转导能促进ubenimex诱导K562细胞凋亡，并可能参与线粒体信号传导通路的调控。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

丁酸钠诱导人慢性髓系白血病K562细胞肺耐药相关基因蛋白的表达

背景与目的：肺耐药相关蛋白(1ung resistance—related protein,LRP)的过度表达是急性白血病患者对化疗不敏感及提示不良预后的指征之一。本研究探讨丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对人慢性髓系白血病K562细胞LRP表达的诱导作用,并初步探讨LRP对细胞内阿霉素(adriamycin,ADM)、柔红霉素(daunorubicin,DNR)浓度的影响。方法：以K562细胞为体外模型,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测NaB作用前后K562细胞LRPmRNA的水平;采用流式细胞仪结合间接免疫荧光检测比较：NaB处理前后K562细胞LRP蛋白表达的变化。分别以流式细胞仪和荧光显微镜检测NaB处理前后：K562细胞内DNR的蓄积和细胞内ADM分布的变化。结果：经2mmol／L NaB处理后较之处理前：①K562细胞的LRP mRMA水平明显增加;②LRP蛋白表达由阴性转为阳性,阳性细胞百分率由1．65%,上升到35．8l％;③经NaB处理后K562细胞内DNR的蓄积明显减少,细胞内DNR平均荧光较处理前减少了68．36%;④ADM在细胞核内分布明显减少,在细胞浆内分布明显增多。结论：NaB可诱导K562细胞LRPm RNA水平和蛋白表达的增加,LRP表达可造成细胞内DNR蓄积减少和ADR由细胞核向细胞浆转移。     

stathmin基因的RNA干涉抑制人白血病K562细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA 干涉(RNA interference,RNAi)抑制stathmin基因表达后对人白血病K562细胞体外增殖的作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体.酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入K562细胞,RT-PCR检测其对mR-NA的干涉效果;MTT 比色法检测K562细胞体外增殖能力.结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒.RT-PCR显示所构建的干涉载体成功地抑制了目的基因的转录,同时细胞增殖活性降低.结论:RNA干涉成功抑制stathmin基因表达并使人白血病K562细胞体外增殖活性明显降低.