正常耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离方法及体会

目的探讨稳定分离用于膜片钳实验的耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞的方法。方法在自制心脏灌流装置上,采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,以膜片钳全细胞方式记录离子流。结果在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞。结论在心肌细胞分离过程中如严格按照本文的介绍,能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞。     

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个,采用Langendorff灌流,行回旋支插管,正常台式液灌流10 s,使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流,同时结扎其他血管及分支,剪去其余心脏组织,待左房及左心耳充盈,无钙台氏液灌流5 min,125 U/ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30~45 min,后用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90%,形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。     

大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨

目的探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞的相关影响因素。方法采用改良Langendorff主动脉逆行灌流法对大鼠全心工作细胞进行酶解分离,分析分离过程中的诸多条件,从中优化最佳的分离方案,为膜片钳实验提供合格细胞。结果分离所用灌流液pH值为7.35~7.40,分离细胞的存活率最高。不同复钙方法对后续细胞存活有明显影响。三步梯度复钙后的细胞存活率明显高于一步、二步复钙法。细胞分离时,灌流速度对细胞存活率有较大影响,3mL/min流速时细胞存活率最高,不同灌流流程对分离细胞的质和量较大影响。采用钙-无钙台氏液先后灌流后再行酶解分离方式可获得长杆状、棱角分明、立体感强的心肌细胞,该细胞复钙后存活率为(56.8±2.6)%;直接使用无钙台氏液灌流后再行酶解分离方法获得(57.2±3.3)%的心肌细胞,其复钙后存活率为(36.7±3.5)%,前述方法明显优于后者。结论灌流液的pH值、灌流速度、细胞分离后的复钙方法及不同的灌流流程等因素可对大鼠心肌细胞的急性分离结果产生显著影响。     

成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性

目的 :摸索成年小鼠心肌细胞分离方法并观察其电生理特性。方法 :采用酶消化法分离单个心肌细胞 ,应用膜片钳全细胞记录技术记录钙电流和钾电流。结果 :本法分离所得心肌细胞横纹清晰 ,一次性复钙 ,可获得 5 0 %～6 0 %的耐钙细胞 ;并具有正常电生理活性 ,易于形成高阻封接 ,可用于钙电流和钾电流记录。结论 :本实验所采用的分离方法经济、简便、成功率高 ,所获细胞具有正常的电生理活性     

Wistar大鼠乳鼠与成年鼠心室肌细胞的分离与性质鉴定

目的 探索和优化稳定的适于电生理实验研究的乳鼠及成年大鼠心室肌细胞分离方法。方法 切碎乳鼠心室肌,胰蛋白酶消化,差速贴壁2 h纯化心室肌细胞,台盼蓝染色判定心肌细胞活力,体外培养48 h后分别行倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化鉴定,微电极阵列记录细胞搏动频率和场电位。采用Langendorff灌流成年大鼠心脏,主动脉逆行插管,胶原酶域反复灌流消化约30 min,无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心室肌组织,台氏液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,将细胞悬液用逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,用于膜片钳记录。结果 经4 -6次消化后,乳鼠心室组织消化完全,细胞存活率大于80%。倒置显微镜下观察,细胞呈梭形、多角形。 12 h有少部分细胞搏动,48 h细胞交织成网,搏动呈同步性,搏动频率30 - 80次/分。 琢鄄辅肌动蛋白（琢鄄actin）经免疫组化检测,纯度达96%。 Langendorff灌流酶解法可获得形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整、立体感强的单个成年鼠心肌细胞,存活率85%,复钙后存活率50%,可用于膜片钳记录。结论 采用本方法可以获得高产量与高质量的用于电生理检测的心室肌细胞。     

降钙素基因相关肽对正常及模拟缺血缺氧心肌钙通道的作用及心肌细胞数学模型的仿真研究

作者运用细胞培养、膜片钳和激光共聚焦技术 ,观察了降钙素基因相关肽 （CGRP）对正常及模拟缺血、缺氧心肌细胞钙通道的作用及其电生理离子机制 ,并利用计算机重建技术在心肌细胞通道动力学及电流重建等方面进行了探索性研究 ,得到了如下提示性结论 :1CGRP对心肌的保护作用有赖于适当剂量和浓度 ;2本课题建立的急性心肌细胞分离方法 ,能够得到具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞 ,是膜片钳实验和激光扫描共聚焦技术测定胞内钙的基础 ;3CGRP对急性缺血、缺氧心肌细胞具有保护作用 ,在急性缺血、缺氧时 ,急性分离的心肌细胞胞内钙离子浓度降低 ,CGRP可引起胞内钙浓度稍微升高 ,且 CGRP可改善因急性缺血、缺氧引起的胞内钙浓度的降低 ,其机制有待于进一步探讨 ;4CGRP能促使正常及模拟缺血缺氧状态下豚鼠心室肌细胞 ICa内流的增加 ,是 CGRP正性作用的主要离子机制 ;CGRP对钙通道的作用机制还有待进一步研究 ;5本课题建立的对几种离子电流的计算机重建方法 ,提示可以被用来讨论离子电流机制 ,是一种新的途径     

心肌细胞的分离和保存

<正> 以前分离心肌细胞的方法是机械分离和钙螯合技术。现在使用酶的技术得到了较好的效果,但该技术存在的问题是分离获得的心肌细胞容易丧失正常结构和在生理浓度的钙液中丧失收缩能力。文献报道了解决这些问题的几种方法,例如应用保护剂,精选组织培养液,特殊的离心方法及孵育液等。本文介绍一种较先进实用的分离心肌细胞     

成熟心肌细胞的培养技术

成熟心肌细胞的培养 ,首先要成功地无菌分离成熟的心肌细胞 ,这比单纯地分离成熟心肌细胞或单纯地培养胚胎期和新生期心肌细胞较困难。一般可作典型的L angandorff装置 ,配合无菌操作要求来得到用于培养的无菌成熟心肌细胞。实验动物等都经消毒灭菌 ,分离仪器保存在分层的通风橱中 ,以免在分离过程上空气传播的污染物污染溶液。其它预防污染的方法有 :1用 70 %酒精彻底清洗分离装置 ,用无菌去离子水冲洗 ,在心脏灌流之前至少要进行两次冲洗 ;2在即将开始分离之前 ,对易于拆卸的装置进行灭菌 ,然后重新装好。分离用灌流液、酶液、保存液及培…     

成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏,为心脏先循环灌流无钙台氏液,后循环灌流酶液,酶解完成后取左心室,迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎,吹打数次后离心,去上清,温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min,梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%,复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状,横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞,能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。     

各部位心肌细胞的分离技术

单个心肌细胞是进行膜片钳实验所必需的，同时制备单个心肌细胞又是十分困难的。本文回顾了心肌细胞分离的历史，介绍了分离心肌细胞的一般方法和应注意的问题，并详细讨论了心脏不同部位组织细胞分离的具体步骤。     

各部位心肌细胞的分离技术

单个心肌细胞是进行膜片钳实验所必需的，同时制备单个心肌细胞是十分困难的。本文回顾了心肌细胞分离的历史，介绍了分离心肌细胞的一般方法和应注意的问题，并详细讨论了心脏不同部位组织细胞分离的具体步骤。     

腺病毒过表达TNNI3K基因对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度的影响

目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad.GFP病毒和Ad.TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。     

LPS引起心肌细胞肌浆网钙漏流的机制及在内毒素心功能损伤中的作用

目的探究LPS引起心肌细胞肌浆网钙漏流的机制及在内毒素心功能损伤中的作用。方法应用膜片钳和激光共聚焦显微成像技术对LPS诱导的败血症休克大鼠心室肌细胞电生理活动以及钙信号的变化及其机制进行研究。结果(1)LPS引起心肌细胞收缩抑制;(2)LPS引起心肌细胞收缩偶联效率降低;(3)LPS引起钙火花发放增加。结论在LPS诱导的败血症休克大鼠模型上,心肌细胞RyR活动增加,钙火花发放增加,肌浆网钙漏流增强,肌浆网钙库容量部分耗竭,胞浆钙蓄积,心肌收缩抑制,导致心功能不全。     

常温灌注预防心脏停跳液引起的细胞水肿

无缺血状态下低温高钾心脏停跳液可引起心肌细胞水肿。但常温心脏停跳液对心肌细胞的影响尚未可知。该研究旨在研究常温高钾心脏停跳液(St.Thomas液)对心肌细胞体积的作用。 方法 取2.8～3.1kg的新西兰大白鼠离体心脏为研究对象,经处理模拟成无缺血状态,经酶解得到相互分离的心肌细胞。将其置于附有摄象系统的显微镜上。以37℃Tyrode液灌注10min后,测得细胞体积基础对照值。分组以37℃、9℃的Tyrode液和St.Thomas液灌注20min,最后均用37℃Tyrode液灌注30min。每组5例标本取自不     

葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响

目的：探讨葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的影响及其抗心律失常的电生理学机制．方法：采用Langendoff胶原酶灌注加浸泡法分离大鼠心室肌细胞，据不同细胞外灌流液将实验分5组：对照组；葛根素1．2，2．4，4．8和9．6mmol／L组．分别用膜片钳全细胞记录各组内向整流钾通道（Ikl）、瞬时外向钾通道（Ito）的电流．结果：在500ms去极化的实验条件下，葛根素使不同去极化水平时的Ikl瞬间电流及稳态电流均明显下降．随着药物剂量的增加，这种抑制作用也增强．结论：葛根素对大鼠心肌细胞离子通道的作用主要是抑制Ikl且抑制呈浓度依赖性．     

胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化

目的:基于目前已有报道的心肌细胞体外消化及分离方法,对胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法进行系统探索和优化。方法:取胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心脏,运用不同方法分离心肌细胞。利用Count Star仪器检测心肌细胞大小及活性。取细胞悬液涂片,针对心肌细胞标志物α辅肌动蛋白(α-actinin)表达进行免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察心肌细胞形态。结果:用胰酶消化法分离胚胎期小鼠心肌细胞,获得存活率大于94%的心肌细胞。用心脏解离试剂盒法(Gentle MACS法)体外分离新生小鼠(出生后1～3 d)心肌细胞,获得存活率约为97%的心肌细胞。分别用Gentle MACS法、非Langendorff灌流法分离出生后4 d和7 d的小鼠心肌细胞,前者仅获得存活率为58%的心肌细胞,而后者获得的心肌细胞存活率为70%～80%。对于成年小鼠,非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法均可获得杆状率、存活率都在70%左右的心肌细胞。结论:结合文献以及本实验结果发现,分离胚胎期小鼠心肌细胞可用胰酶消化法;分离出生后1～3 d小鼠心肌细胞可用Gentle MACS法。对于出生后4 d和7 d的小鼠,非Langendorff灌流法可获得存活率及杆状率均较高的心肌细胞,分离成年小鼠心肌细胞则适合用非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法。     

Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定

目的 探讨Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定方法.方法 采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,然后采用胞内钙荧光测定技术测定细胞内钙离子浓度.结果 在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞.采用荧光探针Fura-2/AM,可准确测定细胞内钙离子浓度.结论 通过本研究采用的方法,不仅可获得大量耐钙心肌细胞,而且可准确测定细胞内钙离子浓度.     

心肌M细胞的认识及其临床进展

人心肌细胞电生理研究,始于60年代。当时由于标本难得,分离心肌细胞技术上存在困难,而影响了心肌细胞电生理学的研究。80年代,由于膜片钳技术的应用、心脏外科和心脏移植手术的开展,人心肌细胞电生理学研究得到了飞速的发展。90年代以来,随着心肌细胞电生理学特别是心肌细胞离子流(离子通道)学研究不断深入,Drouin等在动物实验的基础上证实了人类心肌中存在M细胞,从而为心律失常的发生机制及抗心律失常药物的作用开拓了新的理论。     

钙拮抗剂异搏停对狗暂时性冠状动脉阻塞后心脏坏死的影响

遭受不可逆性损伤的缺血心肌在再灌注后,发生钙大量流入和磷酸钙沉积于线粒体。由于钙是心脏利用能量的主要决定因素,钙负荷过度可促进氧供和氧需比例失衡,从而加速心肌细胞死亡。本文旨在探讨用异搏停抑制钙经过肌纤维膜的流入,是否能延迟或防止缺血性损伤。方法:实验狗在静脉麻醉、气管插管下经左胸切开心包,分离出冠状动脉左回旋支,安置丝线环圈,记录Ⅱ导联心电图,并经股动脉和左室插管监测血液动力学参数(心率、     

新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法：无菌条件下取出出生1~2 d的SD大鼠心脏,用2.5 g/L胰蛋白酶和 2.0 g/L Ⅱ型胶原酶等量混合液在37℃条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90 min纯化心肌细胞,48 h后换液。结果： 将心肌细胞24 h贴壁生长,于2~3 d心肌细胞伸出伪足,形成细胞簇,同步搏动,频率约80~130次/min,存活率为（93.9±2.8）%,纯度为（91.9±2.2）%。结论：以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高,是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。