流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP—N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞,将EGFP—K562细胞与人外周血单个核细胞按10：1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶（PI）标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明：获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP—K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论：EGFP—K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。     

K562和K562/AO2细胞HLA Ⅰ类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLA Ⅰ类分子和MHC Ⅰ类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响.用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAⅠ类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比101时,用抗HLA Ⅰ类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHC Ⅰ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化.结果表明K562和K562/AO2细胞均不表达HLA Ⅰ类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2显增高(P＜0.01).效靶比51、101、201、301时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比101时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性.结论MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLA Ⅰ类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降.     

K562和K562/AO2细胞HLA I类分子与MICA/B的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

本研究探讨K562亲本细胞株及多药耐药细胞株K562/AO2细胞表面HLAI类分子和MHCI类链相关分子(MICA/B)的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。用流式细胞仪检测K562和K562/AO2细胞株HLAI类分子和MICA/B的表达情况;LDH释放法测定3例健康人NK细胞在不同效靶比时对K562和K562/AO2细胞的杀伤活性;效靶比10∶1时,用抗HLAI类分子单克隆抗体(W6/32)和抗MICA/B单克隆抗体(BAMO-1)分别封闭MHCⅠ类分子和MICA/B,观察NK细胞杀伤K562及K562/AO2细胞活性的变化。结果表明:K562和K562/AO2细胞均不表达HLAI类分子,K562细胞的MICA/B表达较K562/AO2明显增高(P<0.01)。效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性分别为(29.32±0.12)%、(45.33±0.78)%、(58.37±0.87)%、(72.37±0.96)和(12.47±0.91)%、(24.36±1.11)%、(33.29±1.03)%、(53.87±1.27)%,各效靶比时NK细胞对K562细胞的杀伤活性较K562/AO2细胞明显增强(P=0.000);效靶比10∶1时W6/32不抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性,BAMO-1能明显抑制NK细胞杀伤K562和K562/AO2细胞的活性。结论:MICA/B在K562和K562/AO2细胞表达的差异与NK细胞的杀伤活性有关;NK细胞对K562/AO2细胞杀伤活性降低与HLAI类分子无关;MICA/B在多药耐药肿瘤细胞的低表达导致耐药肿瘤细胞对NK细胞杀伤敏感性下降。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。     

同种异体NK细胞对AML细胞体外杀伤活性及初步机制

目的探讨同种异体自然杀伤细胞(NK细胞)对急性髓系白血病(AML)细胞株KG1a的杀伤活性及其分子机制。方法以NK敏感的K562细胞株为对照,免疫磁珠法分离5例健康志愿者NK细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定在不同效靶比时NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性,并用流式细胞仪检测KG1a细胞表面人类白细胞抗原I(HLA-I)类分子和NKG2D的配体主要组织相容性复合体(MIC)A/B、ULBP1-3的表达情况。结果效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时NK细胞杀伤K562和KG1a细胞的活性不同,NK细胞对KG1a细胞的杀伤活性较K562细胞明显减低(P<0.01);K562细胞低表达HLA-I类分子,高表达NKG2D配体MIC可溶性Ⅰ类分子相关蛋白A(MICA)、MICA有亲源性的蛋白(MICB)、ULBP1、ULBP2、ULBP3,而KG1a细胞高表达HLA-I类分子,低表达NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。结论同种异体NK细胞对AML细胞株KG1a的杀伤率低于K562细胞;其杀伤率不同的分子基础与其分子表面配体表达差异和HLA-I分子表达率不同有关。     

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪（FAcs）技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562，经过G418筛选后进一步单克隆化，得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5：1、10：1、20：1、40：1的比例混合，分别孵育0．5、1、2、4h后用碘化丙啶（PI）标记，用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数，最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0．5、1、2、4h均能得到明显的杀伤效果，而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法（LDH）具有显著相关性（7=0．997，P=0．003），而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统^51Cr释放法、LDH法的一个补充，而且具有经济、快速和敏感的特点。     

PD-L1表达对NK细胞杀伤急性髓系白血病细胞株活性的影响及其机制研究

目的:探讨不同急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia, AML)细胞株表面程序性死亡因子配体1(programmed death receptor-ligand 1, PD-L1)表达水平对NK细胞杀伤效应的影响及其可能的机制。方法 :抽取健康人外周血,应用miniMACS免疫磁珠阴选法分出NK细胞;流式细胞术检测AML细胞株表面PD-L1表达水平;LDH释放法和单抗体阻断实验分析NK细胞对AML细胞株的杀伤效应;ELISA法检测效靶细胞共培养上清中IFN-γ和IL-2含量。结果:CD3-CD56+NK细胞含量由分选前的(12.44±3.48)%提高到(71.29±5.65)%;流式细胞分析结果表明,KG-1a细胞表面低表达PD-L1(18.35±4.12)%,而THP1细胞表面高表达PD-L1(76.42±26.54)%,同时发现NK细胞对KG-1a具有高效杀伤效应,而对THP1杀伤效果相对较差;联合应用PD-L1单抗可不同程度加强NK细胞对5种AML细胞的杀伤作用,同时促进细胞因子IFN-γ和IL-2分泌。结论:NK细胞对AML细胞株的杀伤活性与靶细胞表面PD-L1表达量有关,PD-L1高表达可抑制NK的效靶杀伤活性,而阻断PD1/PD-L1结合则有益于靶细胞对NK细胞的杀伤作用的敏感性,其机制可能与促进IFN-γ和IL-2释放有关。     

树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对耐药K562细胞的体外杀伤作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞与同源树突细胞(DC)共培养后CIK细胞的增殖活性及表型的变化,并观察其对K562、K562/ADM细胞毒作用的影响。方法采集健康供者外周血单个核细胞(MNC)用于诱导培养CIK细胞及成熟DC,将成熟DC和CIK细胞混合培养,用MTT法检测DCCIK共培养细胞杀伤K562细胞及其耐药株的活性。结果在2.5～20.0效靶比范围内,CIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(20.0±1.2)%～(61.1±2.2)%和(17.5±2.1)%～(45.2±3.3)%;DCCIK共培养细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤率分别为(25.2±2.3)%～(70.9±4.1)%和(22.4±2.7)%～(62.3±5.0)%。CIK细胞对K562敏感株和耐药株杀伤率的差异无统计学意义,DCCIK细胞对敏感株和耐药株的杀伤作用差异亦无统计学意义;DCCIK细胞对K562和K562/ADM细胞的杀伤活性均高于单纯CIK细胞组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论DC与CIK共培养细胞的增殖活性和细胞毒活性高于CIK细胞。     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。     

IL-2/IL-15刺激后脐血NK细胞穿孔蛋白表达及其与细胞毒活性的关系

本研究旨在探讨脐血NK细胞的穿孔蛋白表达水平以及IL-2、IL-15作用下穿孔蛋白表达与NK细胞细胞毒活性的关系。采用CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法纯化脐血NK细胞,流式细胞术测定NK细胞纯度,通过IL-2、IL-2+IL-15两种细胞因子培养体系培养3天,流式细胞术测定培养前后穿孔蛋白表达水平;LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562的细胞毒活性(效靶比10∶1)。结果表明,纯化后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%。,以K562为靶细胞,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2+IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,新鲜纯化CB-NK穿孔蛋白表达率为(67.21±6.14)%,IL-2组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(84.55±3.8)%,IL2-+IL-15组CB-NK细胞穿孔蛋白表达率(87.22±2.2)%。穿孔蛋白表达率与NK细胞毒活性呈正相关(r=88.6,p<0.05)。IL-2组穿孔蛋白表达率与新鲜组差别有统计学意义,IL-2组与IL-2+IL-15组穿孔蛋白表达率差别无统计学意义。结论:促进穿孔蛋白表达是IL-2提高脐血NK细胞细胞毒活性的途径之一。     

Human mononuclear cell modulation of endothelial cell proliferation

Endothelial cell proliferation is a histologic characteristic of several forms of nephritis characterized by infiltration of the glomerulus with mononuclear cells. To investigate the mechanism mediating this event, human endothelial cells isolated from umbilical veins and cultured in vitro were incubated with supernatants of cultured human mononuclear cells. Supernatants from mononuclear cells exerted a dose-dependent stimulatory effect on endothelial cell proliferation. The stimulatory effect of supernatant was almost entirely removed by prior depletion of mononuclear cells of monocytes by adherence, suggesting that a monocyte product was responsible for the activity. To investigate the nature of the ligand responsible, partially purified human interleukin I added to endothelial cell cultures was found to stimulate cellular proliferation.     

胰岛细胞移植过程中细胞受损的提示

背景:胰岛移植后可能发生有害的组织不相容性反应,影响细胞的存活及功能.目的:探讨胰岛细胞移植中早期胰岛细胞的损害程度及原因.方法:采用脑死亡自愿捐赠器官供者的胰腺,采用胶原酶P进行消化分离胰岛细胞,测定不同冷缺血时间下胰岛细胞损害程度.将胰岛细胞与血液进行分组培养,HLA匹配组:受者全血+胰岛细胞,受者全血+胰岛细胞+肝素:错配组:受者全血+胰岛细胞,受者全血+胰岛细胞+肝素;对照组:受者伞血+RPMI1640.观察移植早期可能出现的胰岛细胞损害.结果与结论:胰腺切取顺利,在冷缺血5 h以内胰岛细胞活性率都在80%以上,超过8 h活性胰岛细胞数量只有19%甚至更低.人胰岛暴露于未经抗凝的人血液中,胰岛将诱发一个迅速血细胞消耗.血小板、中性粒细胞和单核细胞计数显示,无论HLA错配还是匹配与对照组相比较血细胞都发牛明显的消耗:加入肝素后HLA错配组及HLA匹配组血细胞消耗反应明显减轻;HLA匹配组胰岛细胞体外培养24 h活性胰岛细胞数量高丁HLA错配组(P<0.05),说明良好组织相容性有利于胰岛细胞存活.结果提示冷缺血时间对胰岛细胞活性的影响很大,在冷缺血时间小于5 h的情况下获取的胰腺可以用于临床胰岛细胞移植的胰腺获取;移植到血液的胰岛细胞会有普遍性的炎症性损害及HLA相关性损害.     

Clear cell renal cell carcinoma

Clear cell RCC is the most common type of RCC that occurs in adults. It has the worst prognosis among the common epithelial tumors of the kidney. Histologically, a wide range of morphologic patterns can be encountered. Those cases with a multi-locular cystic architecture are considered to be a distinct subtype because of the clinicopathologic features.     

急性白血病细胞粘附分子的表达

目的：探讨细胞粘附分子基因在急性白血病的发生和髓外浸润中的作用。方法：运用基因芯片和逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术检测了25例急性白血病神经细胞粘附分子（NCAM）基因、细胞间粘附分子－1（ICAM－1）基因、血管细胞粘附分子－1（VCAM－1）基因的表达。结果：NCAM、ICAM－1、VCAM－1基因在急性白血病表达显著增高，并且有白血病细胞浸润患者粘附分子的基因表达高于无浸润患者，基因芯片检测结果与RT－PCR结果相同。结论：基因芯片能够为急性白血病的相关基因分析提供特异和可靠的数据。急性白血病的发病和浸润机制可能与骨髓细胞中粘附分子表达升高有关。     

嗅鞘细胞诱导树突状细胞成熟的作用研究

目的体外研究嗅鞘细胞(OEC)调节树突状细胞(DC)成熟的作用。方法从流产人胚胎和健康志愿者外周血浓缩白细胞中分别培养OEC和DC。使用DMEM/F-12(5%FBS)培养基,在24孔板中进行10~3OEC、10~3OEC+10~5DC共培养、10~3OEC/10~5DC分室培养、10~5DC或者10~5DC+1μg/mL LPS。在37℃,5%CO_2条件下孵育,48 h后,分别收集培养上清液和DC,用ELISA试剂检测上清中的TNF-α和IL-12p40的含量,流式细胞仪检测DC成熟的表面标志物CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达水平。结果经过10~(-5)mol/L的阿糖胞苷筛选培养12 d,NGFRp75免疫荧光检测表明OEC纯度达到90%以上,RT-PCR检测OEC表达NGF、BDNF、GDNF。OEC作用于DC能够增强DC分泌TNF-α和IL-12p40的表达,DC成熟表面标志物CD40、CD80、CD86和HLA-DR表达增加;同时,细胞因子和成熟表面标志物在分室培养中表达量增加更为显著。结论 OEC体外可诱导DC的成熟,且这种作用为非细胞接触的作用而是OEC通过分泌的可溶性分子作用结果。     

CEUS鉴别诊断肾透明细胞癌和嫌色细胞癌

目的 探讨CEUS对肾透明细胞癌（CCRCC）和嫌色细胞癌（ChRCC）的鉴别诊断价值。方法 收集接受肾脏CEUS检查并经术后病理证实为CCRCC的患者75例及ChRCC的患者26例。观察CCRCC和ChRCC的增强方式、增强程度、增强形态、假包膜征及病灶对局部淋巴结、肾包膜及肾静脉的侵犯情况,并绘制时间-强度曲线,获得校正的始增时间（ΔAT）、达峰时间（ΔTTP）和峰值强度（ΔPI）,进行统计学分析。结果 CCRCC多表现高增强（41/75,54.67%）、弥漫性增强（54/75,72.00%）和不均匀增强（58/75,77.33%）,56.00%（42/75）有假包膜征。ChRCC多表现为低增强（19/26,73.08%）、向心性增强（14/26,53.85%）和均匀增强（17/26,65.38%）,61.54%（16/26）有假包膜征。CCRCC与ChRCC增强程度、增强方式及增强形态的差异均有统计学意义（P均<0.05）,假包膜征检出率的差异无统计学意义（P>0.05）。CCRCC的ΔAT和ΔTTP与ChRCC比较,差异均无统计学意义（P均>0.05）,而CCRCC的ΔPI明显高于ChRCC（P<0.001）。以ΔPI=0.05%为阈值鉴别诊断CCRCC和ChRCC的准确率最高,其敏感度为82.70%,特异度为100%,ROC曲线下面积为0.969。CCRCC出现肾周和（或）肾窦脂肪受累和肾门和（或）腹膜后淋巴结转移的百分率均高于ChRCC（P均<0.05）。结论 CCRCC和ChRCC具有不同的CEUS特征,有助于二者的鉴别诊断。     

Tumor cell growth and cell kinetics

Cancer cells differ from normal cells in many ways, but most importantly by not responding to normal growth-control mechanisms. Whereas the growth and division of normal cells is carefully regulated to meet the needs of the body, tumor cells proliferate autonomously and continually, eventually interfering with and destroying the functions of normal tissue. Knowledge of molecular cell biology has grown exponentially over the last decade. Yet much remains to be understood before there can be a significant impact on our ability to design more effective therapeutic strategies for cancer patients, thereby decreasing mortality.     

Basal cell and squamous cell carcinoma

OBJECTIVES: To describe the clinical and histologic subtypes, pathophysiology, recognition, and treatment options for basal cell and squamous cell carcinoma, and the molecular biology of sunlight-induced carcinogenesis. DATA SOURCES: Journal and review articles, research studies, textbooks, and clinical practice. CONCLUSIONS: Basal cell and squamous cell carcinoma will occur in more than one million cases annually in the United States, and are highly curable when detected and treated early. During the last decade, significant progress has been made in elucidating the molecular basis of skin carcinogenesis and in identifying newer approaches for the management and treatment of these keratinocyte cancers. IMPLICATIONS FOR NURSING PRACTICE: Nurses can play crucial roles in decreasing the morbidity and mortality from the skin cancer epidemic by identifying and referring patients with lesions suspicious for basal cell and squamous cell carcinomas.     

White cell related red cell antibodies

Occasional sera react weakly with a few red cells in the antiglobulin phase but without a recognizable pattern. We sought to identify the nature of such antibodies in 27 samples referred to our HLA laboratory for lymphocytotoxin testing. All samples were tested against a panel of 15 red cells by a capillary tube antiglobulin technique developed to conserve sera. This technique correlates well with tube antiglobulin tests, and can be performed with either fresh or thawed red cells. Of 27 sera, 14 contained anti-HLA B7, B17, or A28, since they reacted only with red cells from donors whose lymphocytes were B7, B17, or A28. Eight further sera probably contained anti-B7, -B17, or -A28, but reacted with one or two additional red cells. Two samples agglutinated all panel red cells so the presence of anti-B7, B17, or A28 could not be determined. In three additional sera, lymphocytotoxin testing suggested that specificity other than anti-B7, B17, or A28 was present. Of 27 sera containing weak unidentified red cell antibodies, 22 (81%) contain definite or probable anti-B7, -B17, or -A28. The identity of these troublesome antibodies can be determined by maintaining red cell panels of donors whose HLA phenotypes are known.