增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。     

利用增强型绿色荧光蛋白体外表达探讨逆转录病毒转染软骨细胞的最佳条件

背景:增强型绿色荧光蛋白是目前最佳标记分子,具有荧光特异性高、易于检测等独特的优势,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染同种异体软骨细胞值得研究。目的:构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,探讨转染同种异体软骨细胞的最佳条件。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学。材料:选用30只出生1周的新西兰白兔,雌雄不限,均购自中国科学院实验动物研究中心。双嗜性逆转录病毒包装细胞系PT67购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞购自ATCC公司;DH5a大肠杆菌由本实验室保存;逆转录病毒载体pLNCX2购自Clontech公司;带有增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。方法:实验于2005-08在上海交通大学完成。分离提取并培养新西兰白兔软骨细胞,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染培养后的新西兰白兔软骨细胞,荧光显微镜观察转染的效果。于直径10cm的平皿接种6×105个软骨细胞,分别立即转染及接种12,24,48h后转染逆转录病毒-EGFP,1周后作流式细胞仪测定EGFP表达效率,观察逆转录病毒转染原代软骨细胞最佳时机。软骨酶消化后的软骨细胞接种24h后转染逆转录病毒,分别于第2,3,4,5,6天加250mg/LG418进行筛选。PBS洗涤后作流式细胞仪检测其效率,观察G418筛选的最佳时机。主要观察指标:①EGFP-pLNCX2转染效果。②逆转录病毒转染原代软骨细胞及G418筛选最佳时机。结果:①重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2转染原代兔软骨细胞,经G418初步筛选而获得的高表达格局,可见软骨细胞经过筛选和表达绿色荧光蛋白后,保持正常的形态学,细胞伸出伪足贴壁,基质分泌旺盛。②逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,第7天用流式细胞仪测定转染效率为19.14%,G418筛选的最佳时机为培养后第5天,第7天测定表达效率提升为55.75%。结论:重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2能有效地转染软骨细胞,逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,G418筛选的最佳时机为培养后第5天。     

大鼠毛囊干细胞的体外分离培养及增强型绿色荧光蛋白示踪

目的：毛囊干细胞具有分化为表皮、皮脂腺和毛囊的能力，在烧伤、创伤及大面积皮肤缺损的细胞治疗和基因治疗等方面均有很好的应用前景，但其特异性标志物和体外培养条件等方面存在争议。实验拟进一步探讨毛囊干细胞体外分离培养的方法，以及增强型绿色荧光蛋白作为其示踪标志物的可行性。 方法：实验于200705／09在解放军第三军医大学细胞生物教研室完成。①材料：新生7d龄SPF级SD大鼠5只，由解放军第三军医大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。pEGFP-N1质粒由本实验室保存。②实验方法：大鼠在体视显微镜下分离出含真皮鞘的完整毛囊，dispase消化，将毛囊从真皮鞘中挤出，收集形态完好且处于生长期的毛囊，分别在毛球部上端、皮脂腺下端横切毛囊，取中间部分置于胰酶和EDTA中联合消化，向所得细胞悬液中添加含10％胎牛血清DMEM／F12完全FAD培养基，常规培养7d后，采用Ⅳ型胶原快速贴壁法两次筛选以分离纯化大鼠毛囊干细胞。待筛选后的细胞生长至70％～80％融合后，进行pEGFP-N1质粒细胞转染。③实验评估：通过超微结构观察与流式细胞仪检测CD34、α6-integrin的表达，对分离纯化的大鼠毛囊干细胞进行鉴定。转染24—72h后，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，以毛囊干细胞克隆形成率判定标记细胞的增殖能力。 结果：①细胞形态及超微结构：筛选后的毛囊干细胞形态均一，呈铺路石状，透射电镜显示细胞胞体小，核浆比例大，核仁明显，细胞器发育不成熟，处于原始状态。②细胞表型：高表达CD34和α6-integrin，细胞阳性率≥90％。③pEGFP-N1质粒转染及示踪：转染16h左右细胞出现微弱绿色荧光，经G418筛选后稳定表达绿色荧光蛋白。④细胞克隆形成率：与转染前比较，转染后细胞克隆形成率明显降低（r=4．541，P〈0．01）。 结论：①利用二步酶消化法联合Ⅳ型胶原快速贴壁法可以获得较高纯度的毛囊干细胞。②增强型绿色荧光蛋白能稳定标记毛囊干细胞，是较理想的示踪方法，但细胞增殖能力受一定影响。     

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构造和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志,为此,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因,并构建可表达ＥＧＦＰ的逆转录病毒载体ＬＧＳＮ,通过脂质体转梁和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞,用以分析对造血细胞标记ＥＧＦＰ基因的可行性,流式细胞术和荧光显微镜检测发现,ＥＧＦＰ病毒转录的ＧＰ＋ｅｖｎＡｍ１２细胞和Ｋ５６２细胞均可发出稳定的绿色荧光信号,阳性率可分别达９７％和８６％,聚合酶链反应分析显示ＬＧＳＮ转子细胞内有原病毒的整合,上述结果提示,作为新一代选择性标志,ＥＧＦＰ是适于研究对造血细胞基因转移与报告基因,对促进人类基因治疗的研究有重要意义。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells．NSCs）的体外培养，探讨NSCs作为基因靶细胞．以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记NSCs的可行性。方法：胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞，无血清细胞培养，免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs，用G418筛选，在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆．并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果：从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力。表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达，且不影响其增殖、分化能力。结论：小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论：基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞

背景:原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。目的:验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。结果与结论:基因转染48h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究

本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率，同时观察绿色荧光蛋白（GFP）作为报告系统用于转染条件优化的可行性。目的基因以GFP为报告系统，通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞，荧光显微镜下观察并计算转染效率。结果表明：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，电穿孔转染效率在10％左右，而脂质体转染效率小于1％。结论：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件。     

K562细胞株侧群细胞分离及耐药蛋白和细胞周期的表达

背景:血液肿瘤细胞中的侧群细胞能够逃避细胞周期化疗药物的作用,可能与白血病复发有关.目的:鉴定人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在侧群细胞,并观察侧群细胞亚群与非侧群细胞亚群耐药蛋白、细胞周期表达的差异.方法:采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在侧群细胞;并分析K562侧群细胞和非侧群细胞两亚群间耐药蛋白P-gp、ABCG2以及细胞周期的表达情况.结果与结论:K562细胞株中均存在侧群细胞,这群细胞比例均少.侧群细胞亚群耐药蛋白ABCG2表达高于非侧群细胞亚群(P < 0.05),两亚群耐药蛋白P-gp中表达差异无显著性意义;侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占80%,非侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占43.7%.证实K562细胞株中确实存在较少比例的侧群细胞,其和主群细胞在耐药蛋白表达上有异质性,大部分处于静止期,可能富含和肿瘤耐药有关的白血病干细胞.     

K562细胞株侧群细胞分离及耐药蛋白和细胞周期的表达

背景：血液肿瘤细胞中的侧群细胞能够逃避细胞周期化疗药物的作用,可能与白血病复发有关。目的：鉴定人慢性粒细胞白血病细胞株K562中是否存在侧群细胞,并观察侧群细胞亚群与非侧群细胞亚群耐药蛋白、细胞周期表达的差异。方法：采用流式细胞术检测K562细胞株中是否存在侧群细胞;并分析K562侧群细胞和非侧群细胞两亚群间耐药蛋白P-gp、ABCG2以及细胞周期的表达情况。结果与结论：K562细胞株中均存在侧群细胞,这群细胞比例均少。侧群细胞亚群耐药蛋白ABCG2表达高于非侧群细胞亚群（P〈0.05）,两亚群耐药蛋白P-gp中表达差异无显著性意义;侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占80%,非侧群细胞亚群中G0/G1期细胞占43.7%。证实K562细胞株中确实存在较少比例的侧群细胞,其和主群细胞在耐药蛋白表达上有异质性,大部分处于静止期,可能富含和肿瘤耐药有关的白血病干细胞。     

流式细胞术检测抗中性粒细胞抗体方法的建立及临床初步应用

目的建立适用于临床的流式细胞术（FCM）检测抗中性粒细胞抗体（ANA）的方法,并作临床初步应用。方法采用FCM,以前向散射和侧向散射参数区分全血标本中的淋巴细胞和粒细胞,设定粒细胞门,用CD16b-藻红蛋白（PE）和CD177-别藻蓝蛋白（APC）单克隆抗体分别检测中性粒细胞中表面表达CD16b和CD177抗原细胞的百分率。用所建方法检测健康对照32名,确定参考范围,以此作为判断受检者血液中抗CD16b或CD177抗体存在与否的依据。检测外周血白细胞（WBC）总数〈4.0×109/L且中性粒细胞绝对计数（ANC）〈2.8×109/L的59例患者的CD16b和CD177百分率,并对其中中性粒细胞表达CD16b和/或CD177百分率低于参考范围（即判为相应抗体阳性）的患者给予激素治疗,观察疗效。结果健康人群中性粒细胞中表达CD16b和CD177的百分率分别为98.36%±1.53%和74.95%±11.07%,据此分别确定了健康人群中性粒细胞表达CD16b和CD177的参考范围分别为CD16b〉95.36%、CD177〉53.25%（即〉x珋-1.96s）。59例患者中有23例（39.0%）ANA阳性,其中ANC〈2.0×109/L患者的ANA阳性率（50.0%）远高于ANC〉2.0×109/L患者（27.6%）。ANA阳性患者经激素治疗后,WBC和ANC上升。结论 FCM检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体是自身免疫性中性粒细胞减少症（AIN）实验简便、快捷的诊断方法,有助于AIN的诊断、鉴别诊断和疗效判断。     

流式细胞仪绝对计数方法及其临床应用

近年来,随着流式细胞术及单克隆抗体的发展,细胞的定量分析越来越广泛地应用于实验室检测及相关研究,如造血干细胞移植中CD34+T淋巴细胞计数,可以确定干细胞动员是否成功;CD4+T淋巴细胞绝对计数,可以很好地对免疫缺陷疾病病做出诊断,并评估治疗效果.目前,采用流式细胞仪进行细胞计数主要有双平台与单平台2种方法.笔者拟对流式细胞仪双平台与单平台细胞绝对计数方法进行介绍,归纳与总结不同生产厂家提供的流式细胞仪绝对计数的原理与优、缺点,以及流式细胞仪绝对计数方法的临床应用,旨在为临床实验室选择合适的流式细胞仪绝对计数方法提供参考.     

流式细胞术检测单个淋巴细胞内细胞因子表达及其临床应用

目的　寻找一种准确、敏感的检测 T淋巴细胞内细胞因子水平的方法 ,为研究 T细胞极化状态在疾病发生发展过程中的作用提供可靠的手段。　方法　用 PMA、 ionomycin作刺激剂 ,刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子 ,以 mon-ensin阻断细胞因子分泌至胞外 ,应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞的膜表面特异的分子和表达并被阻滞在胞内的细胞因子 ,然后用流式细胞仪进行检测和分析。　结果　本方法检测 1 8例正常人淋巴细胞的分泌细胞因子水平 ,其中CD4 + T淋巴细胞中 Th1占 1 9.5 1 %± 4 .96% ,Th2占 1 5 .66%± 3.95 % ;CD8+ T淋巴细胞中 Tc1占 1 6.2 2 %± 1 .78% ,Tc2占 9.2 0 %± 1 .96% ;而 1 2例妊高征孕妇的 Th1、Tc1百分比例明显高于正常人 ( P<0 .0 1 ) ,Th2的比例显著低于正常人( P<0 .0 1 )。　结论　双抗体标记流式细胞仪检测法可以客观、准确地检测淋巴细胞表达细胞因子的水平 ,判断 T淋巴细胞的极化状态。妊高征患者与正常人相比存在 T淋巴细胞的极化水平异常 ,可能与妊高征的发生发展有关     

流式细胞仪检测白细胞胞浆内抗原髓过氧化物酶的实验研究及其应用

目的评价流式细胞仪检测胞浆内抗原髓过氧化物酶（MPO）的方法,探讨实验中各因素对检测结果的影响。方法以HL-60细胞为模型,多参数流式细胞仪分析,比较FACS、Fix＆Perm、Fixation＆Permeabiliza-tion 3种破膜剂处理及不同处理时间、不同荧光染料对实验结果的影响。检测正常人和急性白血病患者的MPO表达情况。结果FACS破膜剂对细胞的前向散射角/侧向散射角（FSC/SSC）影响最小,相对荧光强度（RFI）明显高于其他两者。3种破膜剂在破膜时间15 min时均可达到最佳效果。藻红蛋白（PE）标记的MPO抗体在荧光强度上明显优于异硫氰酸荧光素（FITC）。41例初发急性白血病患者和20例非白血病患者骨髓检测结果证实,MPO为急性髓系白血病诊断中最为敏感的髓系抗原。结论流式细胞仪检测MPO的标准推荐方法：应用FACS破膜剂15 min,标本必须当天完成检测,尽量采用PE标记的MPO抗体。MPO对急性白血病的诊断和分型非常重要。     

流式细胞术检测血小板-单核细胞聚集的影响因素

目的探讨流式细胞术检测全血血小板单核细胞聚集(PMAs)的影响因素。方法分别采用枸橼酸钠和K2EDTA作为抗凝剂,多聚甲醛为固定剂,静脉采集9名志愿者全血,室温和4℃条件下放置不同时间。采用抗CD14PE单克隆抗体标记单核细胞,抗FITCCD42a单克隆抗体标记血小板,流式细胞仪测定各研究条件下PMAs占各自单核细胞总数的百分比。结果在室温和4℃条件下,6h内5mmol/LK2EDTA和0.5%的多聚甲醛不会增加体外PMAs的形成,但它们均能使已形成的PMAs减少。枸橼酸钠抗凝条件下,体外PMAs的形成随时间延长而显著增加,抽血后室温放置30min和抽血后即刻(10min)PMAs测定值之差<3%,分别为6.53%±1.75%和8.80%±2.33%(P<0.05)。结论体外全血PMAs测定易受多种因素影响,抗凝剂枸橼酸钠不影响PMAs的形成及其稳定性,采用枸橼酸钠抗凝需在抽血后短时间内(<30min)测定PMAs。     

流式细胞术检测RhD抗原及其临床应用

目的　探讨流式细胞术 (FCM)检测RhD抗原及其临床应用价值。方法　选取标准的RhD(- )和RhD(+)细胞按 9个不同比例混合 ,分别用直标法 (FITC 抗 D)和间标法 (抗 D和FITC 抗 IgG)染色 ,在FCM上作细胞相对和绝对计数。选择合适检测条件 ,对 2名RhD(- )患者误输RhD(+)红细胞后作RhD(+)细胞计数。结果　与间标法相比 ,直标法检测结果更接近理论值。而单平台和双平台计数法与理论值间无显著性差异 (F =0 .0 32 5 ,P >0 .0 5 )。对 2名RhD(- )的 3份不同时间样本检测发现 ,RhD(+)细胞相对计数分别为 4 .73%、1 0 .87%和 2 0 .86 % ,绝对计数分别为 0 .1 2 4× 1 0 1 2 /L、0 .2 4 5× 1 0 1 2 /L和 0 .5 1 7× 1 0 1 2 /L。结论　FCM能检测RhD(- )细胞中不同浓度的RhD(+)细胞 ,可应用于临床不合血液输注后嵌合态异体细胞的检测     

流式细胞术检测异基因造血干细胞移植后多形性淋巴细胞增殖性疾病——附二例报告

目的 研究流式细胞术检测在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后多形性淋巴细胞增殖性疾病诊断中的作用.方法 采用多色流式细胞术诊断allo-HSCT后多形性淋巴细胞增殖性疾病.结果 2例ailo-HSCT患者分别于移植后46 d(+46 d)和+50 d出现高热,多处淋巴结肿大,抗炎治疗无效,骨髓EB病毒DNA水平升高,经流式细胞术检测发现外周血多群轻链限制性单克隆B细胞和(或)浆细胞.诊断为移植后多形性淋巴细胞增殖性疾病.经免疫抑制减量、抗病毒、使用利妥昔单抗、输细胞毒性T淋巴细胞治疗后,经流式细胞术随访监测外周血和(或)骨髓标本.2例患者的B细胞克隆均消失,但是单克隆浆细胞持续存在或者新出现的克隆.1例患者2周后死亡;另1例患者仍在治疗中,外周血未见B细胞和浆细胞,骨髓未见B细胞,可见单克隆浆细胞.结论 使用流式细胞术可以有效诊断移植后多形性淋巴细胞增殖性疾病,并进行病情监测.随访过程中,骨髓标本可能比外周血标本敏感.allo-HSCT患者如果没有淋巴结活检,通过检测外周血也可以发现B细胞异常.     

全血法流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法建立及临床应用

目的:建立可用于临床检测中性粒细胞抗体的方法,为诊断免疫性粒细胞减少症提供依据,并减少临床标本用血量。方法:使用流式细胞术,对正常人群和不同类型患者群的全血标本检测中性粒细胞表面特异性抗CD16抗体和非特异性IgG型抗体。结果:正常人群中CD16表达>90.78%,相对荧光强度>3255.66。IgG非特异性结合<4.07%,相对荧光强度<11.74。20例临床非自体免疫性患者中性粒细胞抗体检测19例阴性,5例自体免疫性疾病患者检测到3例阳性,6例慢性中性粒细胞减少患者2例阳性。结论:流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法简单,初步结果较为可靠,有临床应用和扩大检测项目的前景。     

人胎血T淋巴细胞和NK细胞的免疫学表达特性

目的探讨人胎儿血T淋巴细胞和NK细胞的免疫学表达特性及其意义。方法用流式细胞仪检测20例胎儿血T淋巴细胞以及NK细胞免疫学标志,包括CD3＋、CIM＋CD28＋、CD4＋CD25＋、CIM5RO＋、CD45RA＋、CD4-CD8-、CD4＋CD8＋、CD4＋或CD8＋细胞的比例以及CD3-CD16＋CD56＋细胞的比例。结果20例胎血中CD3＋细胞百分率平均为（45．43±20．20）％,显著低于文献报道的脐血及正常外周血CD3＋细胞百分率。CD45RO＋细胞百分率为（2．47±2．62）％,显著低于CIM5RA＋细胞的百分率（39．41±19．37）％。胎血CD4＋CD25＋细胞的百分率为（0．764±0．73）％。20例胎血NK细胞标记CD3-CD16＋CD56＋表达为（15．69±9．92）％。胎血NK细胞比例与胎血的孕周龄之间存在负相关（r=-0．446,P=0．049）。结论人胎儿血的T淋巴细胞分化不成熟,较多的保持在初始阶段,且胎血CD4＋CD25＋调节性T细胞的百分率较低,有可能对减少移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发生有益。随孕龄的增长人胎血NK细胞比例有下降趋势。