人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法通过密度梯度离心、贴壁法分离培养人胚MSCs,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化.应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达,并研究其增殖及生长特征.结果原代及传代培养显示,14代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有82%的MSCs处于G0/G1期.MSCs阳性表达CD44,阴性表达CD34、CD45.结论体外培养14代以前的的MSCs生长稳定,增殖较快,可作为组织工程的种子细胞.     

大鼠骨髓间质干细胞的培养及表型特征

目的：分离培养大鼠骨髓间质干细胞，观察生长特性并检测某些表型特征，为进一步研究其分化提供实验基础。方法：活体抽取成鼠骨髓，分离骨髓间质干细胞，进行形态学观察和免疫细胞化学鉴定。结果：分离细胞体外培养呈梭形。7代以前增殖速度较快；免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29，CD44和Fibronectin，但不表达CD34，CD45，CollagenⅡ和Laminin。结论：培养的细胞是骨髓间质干细胞；在体外培养条件下，早期生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

人食管癌间质干样细胞分离培养及生物学特性鉴定

 摘要：目的 探讨人食管癌间质干样细胞（mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma，hEC-MSCs）体外分离培养方法，并对其生物学特性进行鉴定。方法 用胶原酶消化法分离培养人食管癌间质干样细胞，RT-PCR 检测基因表达，流式细胞仪检测表面标记和细胞周期，绘制生长曲线，检测染色体核型，成骨诱导和心肌诱导检测其多向分化潜能。结果 胶原酶消化法分离的hEC-MSCs呈长梭形样，细胞增殖迅速，表达间质干细胞（MSCs）相关基因Oct-4、Nanog、vimentin、N-cadherin，不表达上皮细胞相关基因E-cadherin；表达MSCs相关表面标记CD13、CD29、CD44、CD105，不表达CD33、CD45、CD133、CD14、CD34及HLA-DR。细胞周期分析显示多数细胞处于G0/G1期，少数在S和G2/M期。细胞内含有 46 条染色体, 形态正常；具有分化为成骨细胞及心肌细胞的潜能。结论 胶原酶消化法能有效分离hEC-MSCs，对进一步研究食管癌的微环境具有重要意义。     

人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的:探讨密度梯度离心结合贴壁筛选法分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的条件,为组织工程选择合适的种子细胞奠定基础.方法:采用密度梯度离心法将人MSCs自少量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率,免疫组化与流式细胞仪细胞表型鉴定.结果:人MSCs生物性状稳定.不同代次生长曲线相似,第5～6d细胞数日最多;传代后10 h贴壁率高达90%.MSCs表达CD44、CD90,但不表达CD34、CD45.结论:密度梯度离心法是分离人MSCs的理想方法.MSCs能为组织工程提供足量种子细胞.     

绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较

 目的： 探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞 （MSCs）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点,运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力,台盼蓝法测定细胞传代成活率,采用流式细胞术测定2种第3代（P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达,并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后,细胞贴壁呈成纤维形,2 d后呈漩涡状生长且增殖明显,3 d后达80%融合即可传代;应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs,体外培养4 d后,细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长,5 d后呈克隆样生长且增殖明显,7 d后达80%融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形,骨髓MSCs 生长曲线较平缓;MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显,骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96%以上,G0/G1期细胞均为85%以上,无明显差异（P>0.05）;2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为(60.7±2.3)%以上高表达,CD45、CD19、CD14和CD79a均为(25.6±4.8)%低表达,两者无明显差异（P>0.05）;2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能,脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90%以上,与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（P<0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。     

人脐静脉来源的间质干细胞体外分离扩增及多向分化的研究

目的： 探讨人脐静脉来源的间质干细胞(MSCs) 的体外分离、纯化、扩增和多向分化条件。 方法： 无菌条件下取正常人脐静脉,1%胶原酶Ⅱ消化脐静脉细胞，以IMDM作为培养基进行培养和纯化细胞，瑞氏染色和电镜观察形态；FACS检测其免疫表型和细胞周期；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞分化，von Kossa染色、油红O染色和RT-PCR检测骨钙蛋白、脂蛋白脂酶mRNA的表达以检测细胞向成骨、成脂肪细胞分化情况。 结果： 脐静脉来源的细胞呈纤维样贴壁生长，瑞氏染色和电镜观察具有MSCs特征；FACS检测结果显示, 表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105，而CD31、CD13、CD34、CD45、HLA-DR为阴性；体外诱导成骨细胞、脂肪细胞分化成功。 结论： 人脐静脉来源的MSCs的细胞形态、生长特性、免疫表型、多向分化能力与骨髓来源的MSCs相似，可作为满足实验和临床需要的MSCs来源。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的研究

目的：探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和软骨细胞培养液体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞分化的可能性。方法：采用Percoll分离液分离培养人胚MSCs，体外扩增，用流式细胞仪测定MSCs的CD44、CD71、CD34、CD45表达；在第4代MSCs中加入的条件培养基进行诱导，根据条件培养基的不同分为4组：①IGF-Ⅰ组：培养基中加入100ng／mL IGF-Ⅰ；②软骨细胞培养液组：加入软骨细胞培养液；③联合诱导组：培养液中加入100ng／mL IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液；④对照组：培养基中不加入IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液。采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组化、细胞内蛋白多糖（PG）含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。结果：体外培养的MSCs呈现成纤维细胞样形态，流式细胞仪检测结果显示，MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45；IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液联合诱导15d后，MSCs开始呈现软骨细胞的形态特点，Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性，而未诱导的MSCs组呈阴性；联合诱导组细胞内PG含量为8．92μg／ml，显著高于IGF-Ⅰ组、软骨细胞培养液组和对照组，但低于正常软骨细胞（P〈0．01）。结论：IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导MSCs向软骨细胞分化。     

人脐带间充质干细胞的分离培养及生物学特性

目的建立一种稳定、高效的分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离培养人脐带MSCs,对比其培养成功率;流式细胞术检测脐带MSCs表面抗原及细胞周期;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,观察脐带MSCs向神经元分化潜能。结果组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞表型CD34。细胞倍增时间为30h,G0-GI期和S+G2+M期所占比例分别为78.47%和21.53%。脐带MSCs在体外经诱导分化出现神经元样细胞改变,且表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论成功建立了高效稳定的脐带MSCs分离培养方法,脐带MSCs具备较强的分化潜能和增殖能力,为临床移植治疗提供了理想的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及血管内皮生长因子对其体外诱导分化作用

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞(mcsenchymal stem cells，MSCs)并检测其免疫学表型，探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VECF)对其体外诱导分化作用。方法：利用Pcreoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离、培养、扩增MSCs；采用免疫荧光和流式细胞术检测MSCs免疫学表型；通过VFGF-165基因转染分析MSCs的表型变化。结果：体外分离、培养出高度同源性的MSCs；MSCs具有独特的细胞免疫学表型，即CD44，CD29，c-kit阳性，CD34，CD31，CD54阴性；VEGF-165诱导后CD44表达明显降低，CD31显著升高，MSCs向内皮分化。结论：成功建立人MSCs分离培养方法，探讨了MSCs细胞免疫学表型及VEGF对它的内皮诱导分化作用，为MSCs的应用提供理论基础。     

人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性

背景：高效、稳定地获得大量较高纯度的人脂肪干细胞,是其在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。 目的：探索体外培养脂肪干细胞的适宜条件,从而提高其增殖能力。 方法：采用胶原酶消化的方法,从人腹部皮下块状脂肪中分离出脂肪干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞、低糖培养基体外培养扩增。Giesam染色后观察细胞形态;绘制细胞生长曲线并进行细胞周期分析,观察分析传代后染色体核型改变;选取第3代脂肪干细胞做流式细胞鉴定、EdU细胞增殖能力检测以及克隆形成实验。 结果与结论：分离培养的原代脂肪干细胞形态不一,经传代后的细胞形态趋于长梭形,排列紧密呈漩涡状生长。细胞生长曲线呈S形,细胞周期分析及EdU掺入法结果显示体外培养的脂肪干细胞具有较强的增殖能力。经染色体核型分析结果提示,体外培养不会引起脂肪干细胞的核型改变。第3代脂肪干细胞经流式细胞仪检测CD29,CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性;克隆形成率为8.8%;在一定的诱导条件下,脂肪干细胞能够向脂肪细胞及成骨细胞分化。结果说明采用胶原酶消化法可成功分离培养人脂肪干细胞,且具有较强的增殖能力。     

大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性

背景：研究报道,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以考虑使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究,以期获得更好的实验结果。查阅国内外相关文献,目前尚未发现大鼠胎盘来源间充质干细胞的相关报道。 目的：建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性。 方法：通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞。每天用倒置显微镜观察其形态。用MTT法测定其生长动力学并绘制生长曲线。用流式细胞仪检测其表型及细胞周期。通过免疫组化法证实其成脂及成骨分化的潜能。 结果与结论:原代细胞培养8 h后细胞贴壁,24 h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主。细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%。免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45。体外诱导实验证实胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。     

体外传代培养成体大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的观察

目的观察成体大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外培养过程中生物学特性的改变,为骨髓间充质干细胞的应用研究提供实验依据。方法成体大鼠骨髓MSC的分离培养,流式细胞仪观察MSC免疫表型及细胞周期,检测细胞的诱导分化能力以及细胞的生长曲线,TRAP—ELISA方法检测其端粒酶活性。结果体外培养的成体大鼠MSC,随着传代次数的增加,长梭形细胞的体积逐渐增大。第4代时免疫表型阳性细胞率分别为CD29：（94．75±3．68）％,CD71：（95．43±2．23）％,CD90：（98．08±3．88）％;当传到第7代时,阳性细胞率仅为CD29：（50．00±3．35）％,CD71：（50．70±2．43）％,CD90：（48．60±2．83）％;第9代时MSC检测不到任何阳性免疫表型。前5代MSC增殖较快,第3代时处于S期和G2／M期的细胞比例为（38．36±2．01）％,处于G0／G1期细胞为（61．64±2．13）％;第7代以后细胞增殖能力明显降低,第12代时处于S期和G2／M期的细胞为（10．83±1．63）％,而G0／G1期的细胞为（89．17±1．96）％,此时MSC已经基本停止增长。当体外培养的MSC传到第9代以后,在成骨和成脂肪诱导体系作用下,细胞丧失了分化为Von Kossa法染色和油红O染色阳性细胞的能力;同时其端粒酶活性也随着传代次数的增多由最初的（52．7±0．78）％逐渐降低为阴性。结论体外培养的成体大鼠骨髓MSC随着传代次数的增加,其生物学特性发生明显改变。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。 目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。 方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。 结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

低血清培养对骨髓间充质干细胞细胞周期同步化的影响

目的探索骨髓间充质干细胞细胞周期同步在G0/G1期的培养条件。方法培养骨髓间充质干细胞并用CD44、CD90、CD71、CD11b进行流式细胞术鉴定,观察50、5和100mL/L胎牛血清培养条件下细胞周期的变化情况及对细胞凋亡的影响。结果骨髓间充质干细胞CD44、CD90、CD71阳性,CD11b阴性。50mL/L胎牛血清培养1d和5mL/L胎牛血清培养1~3d可使G0/G1期细胞比例减少,S期和G2期细胞比例增加,但随着时间延长,G0/G1期细胞比例明显增加,S期和G2期细胞比例减少,细胞周期阻滞在G0/G1期,50mL/L胎牛血清不增加细胞凋亡比例,5mL/L胎牛血清在3d内使细胞凋亡比例明显增加,随时间延长又逐渐下降。5mL/L胎牛血清培养5d组G0/G1期细胞比例增加最为明显,由75.9%上升到89.4%,凋亡细胞比例仅为0.162%。结论5mL/L胎牛血清培养5d是使间充质干细胞细胞周期同步在G0/G1期的理想的培养条件。     

采用组织贴壁法从整根脐带分离培养间充质干细胞及其生物学特性的研究

 为了建立从整根脐带中分离培养间充质干细胞(UC-MSCs)的技术,并对其生物学特性进行研究。采用组织贴壁法分离UC-MSCs, 并通过传代进行纯化和扩增培养, 绘制生长曲线：用流式细胞仪检测UC-MSCs表面抗原及细胞周期; 在特定诱导体系中,检测UC-MSCs向脂肪、成骨及软骨分化的能力;采用RT-PCR检测多能干细胞标志多能干细胞标志Oct4, Sox-2, Nanog mRNA水平。结果表明,　成功建立了UC-MSCs分离培养的方法;流式细胞仪检测结果显示, 贴壁细胞均表达CD73 、CD90 、CD105, 不表达造血细胞表型CD34、CD45 和HLA-DR ;细胞倍增时间为(24.04±0.49)h , 细胞周期分析表明,G0～G1 期和S+ G2 + M 期所占比例分别为81.56 %和18.44%;UC-MSCs能够向脂肪、成骨和软骨分化;表达Oct4, Sox-2, Nanog基因。结论：组织贴壁法是一种较好的分离培养UC-MSCs的方法,培养的细胞为具有增殖能力强和更原始间充质干细胞,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。     

长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性及其限制性

背景：间充质干细胞具有多向分化能力、免疫调节能力,并可在体外进行长期培养扩增,但其体外长期培养的生物学活性变化特点及其限制性仍不十分清晰。 目的：观察体外长期培养人脐带间充质干细胞的生物活性变化特点及其限制性。 方法：无菌收集剖宫产新生儿脐带,经胶原酶Ⅱ消化后,用黏附生长选择法获取人脐带间充质干细胞,胰酶消化传代;取第3代细胞进行流式分析,脂肪和成骨诱导鉴定;收集不同代的细胞分别用MTT法、流式细胞仪和爬片分析法检测细胞增殖活性、细胞周期、凋亡率及黏附能力。 结果与结论：人脐带间充质干细胞的细胞表型CD105⁺/CD29⁺/CD44+/CD31^-/CD34^-/CD45^-/HLADR^-,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;传代培养第3~23代细胞形态无明显变化,生长曲线基本一致,第28代后细胞增长缓慢;流式分析发现第33代细胞较第3代G0/G1减少17.9%、S+G2/M增加103.4%、细胞凋亡率增加316.7%,差异均有显著性意义(P < 0.01),第3~18代细胞间G0/G1、S+G2/M、细胞凋亡率和黏附细胞数差异均无显著性意义(P > 0.05)。提示在体外长期培养环境中,随着传代次数的递增,人脐带间充质干细胞的增殖及黏附能力下降,细胞凋亡率增加,总的生物活性呈逐渐下降趋势,其最佳生物活性期出现在培养第3~18代之间。     

体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞的增殖与分化规律

目的：系统考察体外扩增过程中人骨髓间充质干细胞（MSC）的增殖与分化规律，为MSC任组织修复以及细胞治疗中的应用提供参考、方法：以全骨髓贴壁法分离成人肋骨骨髓MSC，在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、细胞周期、成骨、成软骨及成脂肪能力的变化情况。结果：随代次增加，MSC增殖能力、成骨、成脂肪能力均有所下降，而成软骨能力无明显降低；成骨、成软骨及成脂肪能乃均保持到细胞衰老。存扩增过程中，MSC始终保持较高的纯度，CD29、CD44、CD105的阳性率均在90％以上，CD14、CD34和CD45的阳性率均在4％以下、结论：在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失，其中向骨、脂肪方向的分化潜能较软骨方向更易失去；而多向分化能力的保持较之自我更新能力更为持久。MSC在7代以前可作为基础研究及临床应用的良好对象。