基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究

目的探讨基质金属蛋白酶3在创伤愈合过程中的变化及其意义。方法取伤后1d伤口液作为创伤修复启动微环境，刺激真皮多能干细胞，24h后检测细胞表达MMP3含量的变化。同时制作单纯创伤和难愈创伤动物模型．通过免疫组化和图像分析方法观察伤后不同时相伤口组织MMP3含量变化。结果创伤早期伤口液作用真皮多能干细胞后表达MMP3显著增加。正常大鼠皮肤组织成分可见一定量的MMP3表达，阳性细胞主要为表皮细胞、毛囊外根鞘细胞、真皮成纤维细胞、血管内皮细胞等。单纯创伤大鼠伤后各时相点MMP3表达均显著增加，特别是以真皮组织增加更为明显．其峰值在伤后5，7d。难愈创伤组大鼠伤I：I局部MMP3含量在伤后各时相点亦显著增加，但与单纯创伤组相比，其含量在伤后3、5、7d均显著减少，尤以真皮组织表达减少更为明显，并且MMP3表达峰值延迟，为伤后10d。结论MMP3是一种重要的创伤愈合调节分子；通过高表达MMP3可能是真皮多能干细胞参与创伤修复的途径之一。     

真皮多能干细胞在创伤愈合中作用的实验研究

目的研究真皮多能干细胞的部分基本生物学特性，观察其在创伤愈合中的意义。方法采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞；利用流式细胞技术观察真皮多能干细胞周期变化；四唑盐比色试验（MTT法）观察其辐射敏感性。收集伤后1，2，3和4d伤11液，观察其对真皮多能干细胞的反应性。结果分离、纯化的真皮多能干细胞形态较为均一，增殖能力强；培养的细胞凋亡数量少，多处于静止期，对辐射极为敏感；这种细胞增殖对伤口液具有良好的反应性，尤其伤后早期伤口液作用更为明显。结论发育成熟的个体中仍存在较为幼稚的真皮多能干细胞，它们在创伤愈合过程中具有重要意义，特别是在创伤修复启动中的作用值得进-步深入研究。     

白细胞蛋白酶抑制因子对真皮间充质干细胞增殖的影响

目的：研究白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）在真皮间充质干细胞（dMSCs）中的表达以及促dMSCs增殖的作用.方法：采用前期建立的技术分离、纯化并扩增真皮多能干细胞,在大鼠背部置入聚乙烯酒精海绵收集伤后1天伤口液,用Tripure细胞裂解液提取伤口液刺激前后dMSCs和创伤前后大鼠皮肤组织中总RNA.通过RT-PCR检测伤口液刺激前后dMSCs和创伤前后大鼠皮肤组织中SLPI mRNA的表达.用M-PER抽提细胞蛋白,了解伤口液刺激前后dMSCs中SLPI蛋白表达的变化.无血清IMDM培养液培养细胞48h,加入不同浓度的SLPI因子刺激dMSCs,通过[H3]Thymidine掺入实验研究SLPI对真皮间充干细胞的增殖作用.结果：分离的大鼠dMSCs呈梭形,在体外显示多向分化潜能.RT-PCR和Western blot提示SLPI在dMSCs中表达,伤口液刺激后表达增强.通过[H3]Thymidine掺入实验发现加入SLPI因子后,细胞增殖明显增强.结论：SLPI在dMSCs中表达,能够促进dMSCs的增殖,通过高表达SLPI可能是dMSCs参与创伤修复的重要途径之一.     

表皮、真皮因素对创面愈合中成纤维细胞生物学行为的影响

成纤维细胞参与创面愈合的全过程，是创伤愈合中主要的修复细胞之一，创伤后成纤维细胞被激活，发生迁移、增殖，分泌包括胶原在内的细胞外基质，参与肉芽组织及疤痕形成。在这一过程中成纤维细胞的生物学行为受多种因素的调控。表皮成分、真皮模板通过对成纤维细胞生物学行为的影响，可减少创伤后伤口收缩以及疤痕增生，从而改善了创面愈合质量。     

RNA解旋酶p68在真皮多能干细胞增殖调控中的作用

目的研究RNA解旋酶p68在真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,DMSCs)增殖过程中的表达特点,并探讨其在创伤愈合中的意义。方法通过免疫细胞化学和Western blot方法检测p68在DMSCs不同生长状态的表达特点,早期伤口液刺激对DMSCs中p68表达的影响并通过MTT法检测DMSCs增殖的变化,进一步通过RNAi抑制p68表达之后检测细胞增殖的变化特点。结果增殖活跃的DMSCs中p68表达较强,饥饿以后,p68表达降低;伤后1 d伤口液可明显促进DMSCs中p68的表达及细胞增殖(P<0.01);RNAi抑制p68表达之后DMSCs增殖明显受抑(P<0.01)。结论RNA解旋酶p68参与DMSCs的增殖调控,创伤微环境在修复细胞的启动中可能发挥作用。     

QY1骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化

目的:探索QY1骨髓多能间质干细胞系在体外向心肌细胞、血管内皮细胞分化的能力;优化骨髓多能间质干细胞向心肌细胞分化的体外适宜诱导条件;并初步探讨骨髓间质干细胞向成心肌成血管细胞分化的能力.方法:分别用5-氮胞苷、血管内皮生长因子对QY1骨髓多能间质干细胞进行定向诱导分化.利用免疫组化、RT-PCR鉴定分化后的细胞.结果:在传代培养至72 h时,加入10 μmol/L5-氮胞苷诱导24 h后换液培养,以后每7 d换液1次,培养14 d进行再次诱导的条件下,细胞能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,诱导率达(39.47±0.56)%.心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在用血管内皮生长因子诱导48 h后,出现呈直线排列的血管内皮细胞;7 d后,有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状;14 d时免疫组化检测,发现诱导后的细胞血管内皮特异性表面抗体CD31和Ⅷ因子表达阳性.结论:QY1骨髓多能间质干细胞系细胞在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力.     

RSK2通过调控人皮肤成纤维细胞的增殖与迁移促进皮肤创面修复

目的：探究RSK2对皮肤创面修复的影响及其可能机制。方法：采用Western blot与免疫荧光染色实验检测皮肤创伤组织中RSK2的表达差异。通过人原代真皮成纤维细胞（HDF）划痕实验、CCK-8增殖实验及Western blot实验,在细胞水平探究RSK2抑制剂Bix 02565对HDF的作用。通过HE染色、Masson染色与免疫荧光染色,在体内水平观察RSK2抑制剂对皮肤创面修复的影响。结果：Western blot及免疫荧光实验结果显示皮肤创伤并不影响皮肤成纤维细胞中RSK2总蛋白的表达,而在体外水平上利用Bix 02565抑制RSK2的活性可显著抑制成纤维细胞的增殖与迁移,抑制G1/S-特异性周期蛋白-D1（Cyclin D1）与纤维粘连蛋白（Fibronectin）的表达,在动物水平RSK2抑制剂可抑制成纤维细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）与胶原纤维生成,抑制血小板-内皮细胞黏附分子（CD31）的表达,阻滞血管的新生,延缓小鼠皮肤创面修复速率。结论：RSK2可通过促进成纤维细胞的增殖与迁移、血管新生,进而促进皮肤创面修复。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成.这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞.间充质干细胞(mesenchymal stemce lls,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1].     

人循环成纤维细胞的体外培养和初步鉴定

自1994年Bucala等\[1\]首次确认了外周血中循环成纤维细胞这一白细胞亚群的存在后,其便逐渐成为了创伤及纤维化病变领域的研究热点。循环成纤维细胞以同时表达部分造血来源细胞（CD34、CD45RO、CD11等）和间质细胞分子（CollagenⅠ、Ⅲ等）标记为特征,可继续分化为肌成纤维细胞。此外,循环成纤维细胞还能够提呈抗原,启动炎症反应;分泌转化生长因子（TGF）-β等纤维形成因子,促进定植于组织中的成纤维细胞增殖、转化及迁移\[2-3\];分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和血管内皮生长因子（VEGF）等血管形成因子,促进内皮细胞增殖、迁移,加快新生血管的形成\[4\]。通过以上多种作用参与创伤修复、脏器纤维化及血栓形成等病理过程。目前国内尚鲜有此方面研究。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.     

M2型巨噬细胞外泌体对皮肤创面愈合影响的探究

目的:探究M2型巨噬细胞来源的外泌体（M2exos）对成纤维细胞增殖、迁移的影响。方法:极化RAW264.7细胞并收集M2型巨噬细胞上清,提取并鉴定M2exos。通过免疫荧光观察L929真皮成纤维细胞对M2exos的摄取情况,设对照组和M2exos组,通过CCK-8、细胞划痕实验分别观察在0、24、48、72 h对成纤维细胞的增殖和迁移作用。建立皮肤创口模型,随机将12只C57BL/6J小鼠分为PBS组和M2exos组。两组分别注射200 μL PBS、M2exos（500 μg/mL）,在第1、4、7天观察、拍摄记录,并取材进行HE染色。结果:成功极化得到M2型巨噬细胞,提取和鉴定了M2exos。与对照组相比,M2exos组在48、72 h对成纤维细胞具有促进增殖（t=26.73,P＜0.000 1;t=6.648,P＜0.01）、迁移（t=5.196,P＜0.05;t=22.00,P＜0.000 1）作用。对C57BL/6J小鼠的研究显示,与PBS组相比,在第4、7天时M2exos组创面显著缩小（t=32.80、 51.16,均P＜0.000 1）。结论:M2exos通过促进成纤维细胞增殖和迁移,对小鼠创面愈合有显著的促进作用。     

正常人毛乳头细胞和真皮鞘细胞的生长特性观察

目的 观察毛乳头细胞和真皮鞘细胞在体外培养条件下的生长特性。方法 采用胶原酶消化法培养正常人头皮毛囊的毛乳头细胞和真皮鞘细胞,在体外进行传代培养,测定毛乳头细胞不同时相点的细胞数,并观察表皮细胞生长因子、氢化可的松＋胰岛素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对毛乳头细胞和真皮鞘细胞增殖的影响。结果 毛乳头细胞、真皮鞘成纤维细胞和真皮成纤维细胞的生长呈现３个时相,即停滞期、指数生长期和缓慢生长期。３种细胞都有４ｄ的停滞期,５～１１ｄ为指数生长期,之后呈现出缓慢生长。ＥＧＦ对３种细胞都有显的促进作用（Ｐ〈０．００１）,尤其是对真皮鞘成纤维细胞的作用更强。氢化可的松和胰岛素、ＧＭ－ＣＳＦ对３种细胞的作用不明显。毛乳头细胞、真皮鞘细胞和成纤维细胞的倍增时间分别为６０、５９．２、７６．８ｈ。结论 ＥＧＦ对毛乳头细胞、真皮鞘细胞和     

抑郁复合皮肤创伤对创面微血管及成纤维细胞生长的影响

目的：观察抑郁复合皮肤创伤对创面新生微血管及成纤维细胞消长的影响。方法根据建模方法将144只SD大鼠随机分为单创组、创伤复合抑郁组、抑郁复合创伤组,每组48只,制备抑郁模型。分别采用CD34、Vimentin抗体行免疫组织化学标记血管内皮细胞及成纤维细胞,高倍显微镜下计数。结果伤后第3天单创组和创伤复合抑郁组大鼠的创面微血管数显著高于抑郁复合创伤组（P＜0．05）,第21天时各组间微血管计数无显著差异;伤后第3天抑郁复合创伤组创面成纤维细胞虽少于单创组和创伤复合抑郁组,但差异无统计学意义（P＞0．05）;创伤后第18～21天,3组间成纤维细胞数量比较,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论抑郁复合皮肤创伤时,创面肉芽组织中微血管及成纤维细胞的生长合成可被显著抑制,使伤口愈合延缓。     

在创伤愈合中VEGF和Ang-1表达的生物动力学变化研究

目的研究大鼠皮肤损伤愈合过程中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和促血管生成素-1（Ang-1）表达的动态变化，阐明其在组织修复血管再生中的作用。方法在大鼠背侧切开皮肤全层建立大鼠创伤模型，不同时问后活体取材，应用HE染色观察组织病理形态学变化；应用免疫组化SP法检测VEGF和Ang-1的蛋白表达。结果伤口组织病理学检查可见，毛细血管在伤后第3d即见增多，伤后第7d达高峰，随后逐渐减少。血管内皮细胞胞浆VEGF蛋白表达在伤后第1d呈阳性。伤后第3d呈强阳性，伤后第5d呈阳性，而于伤后第7d阳性程度逐渐减弱。伤后第1～14d VEGF蛋白表达与对照组比较，有非常显著性差异（P〈0．01）。血管内皮细胞胞浆Ang-1蛋白表达在伤后第1d部分呈阳性表达，部分呈弱阳性表达，在伤后第3d呈阳性表达。伤后第5、7d呈强阳性、阳性表达。随后阳性程度逐渐减弱。伤后第3～21d Ang-1蛋白表达与对照组比较，有非常显著的统计学差异（P〈0．01）。结论VEGF和Ang—1在血管内皮细胞中的表达强度与组织损伤愈合程度密切相关，在创伤愈合过程中互相协调、促进并调节血管肉芽组织的生长和成熟。     

感染伤口愈合过程中负压引流对成纤维细胞的影响

目的了解负压引流在感染伤口愈合过程中成纤维细胞数量的变化。方法选取40只成年健康日本大白兔,在颌面部、大腿部建立感染伤口模型,按数字随机表法分为实验组和对照组各20只,实验组清创后负压引流,对照组常规方法处理。两组于清创后1、3、5、7 d处死动物,取创面标本光镜下计数成纤维细胞。结果术后第1天实验组腿部成纤维细胞数量明显多于对照组（P〈0.05）;术后第1、3天实验组面部成纤维细胞数量多于对照组（P〈0.05）。结论负压引流可促进感染伤口成纤维细胞计数增加,从而加速伤口愈合。     

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对烫伤大鼠创面愈合及新生血管化的影响

目的:研究重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)对烫伤创面组织愈合及新生血管化的影响。方法:72只SD大鼠于背部制备直径3 cm的深Ⅱ度烫伤创面。根据创面不同处理方式将大鼠随机分为实验组(创面局部应用rhGM-CSF凝胶剂)和对照组(创面局部应用不含rhGM-CSF的凝胶基质),每组36只。分别于创面形成后当日和第1、3、7、10、14、21天观察创面并计算创面愈合率;免疫组织化学染色观察创面组织中新生血管内皮细胞表面标志物CD31表达,计算微血管密度。结果:自创面形成后第7天起,实验组创面愈合率明显高于对照组(P0.01),实验组创面组织中CD31表达及微血管密度也均明显高于对照组(P0.01)。结论:外用rhGM-CSF具有促进烫伤创面愈合作用,其机制可能与上调创面组织中CD31表达、使新生血管再生加速有关。     

Expression of oncoproteins c-fos and c-jun in hypertrophic scars and chronic dermal ulcers and their regulation of basic fibroblast growth factor

目的　探讨c fos与c jun两种原癌基因产物在溃疡与增生性瘢痕创面表达的特征与规律以及与不同组织修复结局发生的关系。方法　 16例标本均取自于外科手术患者 ,其中增生性瘢痕 8例 ,溃疡创面 8例 ,另有正常对照皮肤 5例取自增生性瘢痕患者作为对照。用免疫组化法 (ABC法 )检测c fos与c jun两种癌蛋白以及bFGF在三种组织切片的分布特征。结果　在正常皮肤c fos与c jun的阳性表达主要见于表皮基底细胞和少量皮下成纤维细胞 ,但在相应部位c jun的表达较c fos为弱。在增生性瘢痕 ,c fos与c jun均出现强阳性表达 ,主要见于成纤维细胞。在溃疡组织 ,c fos与c jun的联合表达多见于毛细血管内皮细胞、部分炎症细胞以及成纤维细胞胞浆。结论　增生性瘢痕与溃疡创面c fos与c jun表达量与部位同正常皮肤存在显著差异 ,提示这两种原癌基因产物在影响和调控组织修复中有重要作用。