小鼠cbfa1多克隆抗体制备及在骨和牙胚中的表达

目的　制备cbfa1多克隆抗体并进行鉴定和效价分析 ,观察其在骨和牙胚中的表达情况。方法　用自制的融合蛋白免疫新西兰大白兔 ,制备多抗血清 ,提取小鼠牙胚、颅骨和肝脏组织的总蛋白进行westernblot ,同时采用免疫组化染色观察其组织表达特性。结果　cbfa1蛋白在小鼠颅骨和牙胚组织中均有表达 ,在人骨肉瘤细胞系中呈强阳性表达。在免疫组化和westernblot的有效作用滴度分别为 1:40 0和 1:10 0 0。结论　成功地制备了兔抗小鼠cbfa1多克隆抗体     

免疫金银法在小鼠牙胚细胞外基质免疫组化研究中的应用

细胞与细胞间质之间相互作用在组织的发生、发育中的重要性已众所周知.胞外基质(ECM)在牙胚的形态发生和细胞分化方面起着重要作用.纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)是牙胚组织中的重要间质成分.为了观察FN在牙胚发育中的分布特征和变化,分析FN等间质与牙乳头细胞分化的关系,更好地进行胞外基质的观察,作者利用免疫组化技术,将免疫金银法(Immunogold silver staining,IGSS)和微波结合,用于小鼠牙胚FN的染色观察中,取得了较好的效果,现将方法介绍如下:     

骨涎蛋白在人牙胚和下颌骨发育中表达的研究

目的：观察骨涎蛋白（BSP）在人牙胚发育和分化过程中的分布情况。方法：采用免疫组化和原位杂交的方法进行人牙胚和下颌骨中BSP的定位研究。结果：钟状期牙胚中成牙本质细胞BSP为强阳性，成釉细胞、前期牙本质和釉质为阳性；骨组织和成骨细胞呈强阳性；外釉上皮、星网状层、中间层、内釉上皮和牙乳头为阴性。免疫组化与原位杂交的结果基本一致。结论：BSP与矿化组织如牙本质、釉质、骨组织的形成和矿化有关。     

小鼠cbfa1部分编码区在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达cbfal肽段并进行纯化，为进一步制备抗体奠定基础。方法 构建pRSETA-cbfal原核表达重组质粒，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，采用Ni-NTA亲和层析柱进行初步纯化。结果 成功地将204bp的cbfal片段插入pRSET A原核表达载体中，且位于T7启动子下游、读框正确，在0．1mmol／L的IPTG诱导下，SDS-PAGE电泳可见在约14KD处有蛋白新生带，用Ni-NTA柱亲和层析纯化融合蛋白，得到的cbfal蛋白纯度大于95％。结论 转录因子cbfal部分编码区能够在体外大肠杆菌中获得融合表达。     

牙齿发育相关基因adam28多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备及鉴定抗ADAM28的多克隆抗体。方法采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出adam28基因的蛋白编码区序列,克隆到中间载体pMD18-T Vector中,再经双酶切得到adam28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,经过初步纯化及SDS-PAGE电泳,在35300的新蛋白带处直接割胶,作为抗原免疫新西兰大白兔后获取抗体。结果成功构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白,免疫兔子1个月后,获得免疫血清,盐析法纯化得到多克隆抗体。Western印迹结果显示所得到的抗体具有较高的特异性,ELISA分析证实其效价可达1∶16000。结论成功制备出高效价的抗ADAM28多克隆抗体,为进一步研究ADAM28在牙齿发育中的作用和表达分布奠定基础。     

L型钙离子通道α 1亚基D亚型在发育小鼠磨牙牙胚成牙本质细胞中的表达

目的：研究成牙本质细胞分化不同阶段L型钙离子通道α1亚基D亚型的分布情况。方法：采用兔抗小鼠L型钙离子通道α1D亚基多克隆抗体进行牙胚免疫组织化学染色。结果：在前成牙本质细胞胞体，功能性成牙本质细胞的近矿化端以及成熟成牙本质细胞的胞体和突起上均发现有L型钙离子通道α1亚基D亚型分布，结论：成牙本质细胞可能通过L型钙离子通道α1亚基D亚型转运钙离子参与牙本质矿化过程。     

BSP、OPN在小鼠牙胚发育中的表达

目的:探讨骨涎蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在Balb/c小鼠牙胚发育各期的时空分布特点及两者在牙齿矿化过程中的作用。方法:采用免疫组化法观察Balb/c小鼠出生前后牙胚及颌骨中BSP、OPN的表达与分布。结果:BSP、OPN在牙胚发育中的时空分布模式存在差异。OPN在蕾状期的表达弱于BSP,两者在成釉器早期的发育中作用微弱;在帽状期、钟状期及牙体硬组织(牙冠、牙根)分泌形成期,OPN的表达范围及强度高于BSP,尤其在牙体硬组织形成期,OPN在牙胚各类细胞及骨组织中均呈强阳性表达。结论:BSP、OPN参与牙胚的发育及牙体硬组织的矿化成熟,在牙齿发育中发挥关键作用。     

骨涎蛋白、骨桥蛋白在小鼠骨组织和牙胚组织发育中的表达

目的:探讨骨涎蛋(bone sialoprotein,BSP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在小鼠骨组织和牙胚组织发育过程中的分布特点及两者在骨组织形成和牙矿化过程中的作用.方法:取E16d胎鼠及出生后第10、30天的BALB/c小鼠共9只,拉颈处死,分离解剖下颌骨及其他骨组织,新鲜配制4%多聚甲醛固定过夜,常规石蜡包埋,近、远中向5μm连续切片,采用免疫组化法检测E16d胎鼠不同骨组织及10d、30d小鼠牙胚组织中BSP、OPN的表达及分布情况.结果:BSP、OPN在牙胚及骨组织发育中的分布模式存在差异.BSP在已经矿化成熟的矿化组织基质中呈阳性表达,而OPN主要在矿化的前沿及矿化活性强的矿化组织中强阳性表达.结论:BSP、OPN参与骨组织的发育和牙胚组织的矿化成熟,并在小鼠牙及骨组织的形成和矿化中具有重要作用.     

氯离子通道CLC-3在小鼠牙胚发育中的表达

目的:探讨CLC-3在BALB/c小鼠下颌第一磨牙牙胚不同发育时期的时空表达。方法:选取E13.5、E15.5、E18.5 d的BALB/c胎鼠和P1、P5 d的BALB/c小鼠,脱颈处死后取其头部,梯度乙醇脱水,石蜡包埋后连续切片,最后对石蜡切片行CLC-3免疫组化染色。结果:当胎鼠牙胚处于蕾状期时,CLC-3在牙胚的牙板上皮中可见表达;当牙胚发育为帽状期时,在牙乳头和牙囊细胞中表达;到钟状期时,CLC-3在牙乳头、牙囊、星网状层细胞和中间层细胞中广泛表达。出生后的小鼠CLC-3在牙乳头、牙囊、成釉细胞、成牙本质细胞、星网状层细胞、中间层细胞中均广泛表达。结论:CLC-3在小鼠牙胚发育的不同时期呈现不同的时空表达。     

Smad1在人牙胚发育过程中的表达变化

观察骨形成蛋白特异的细胞内信号转导分子Ｓｍａｄ１在人牙胚发育过程中的表达变化,探讨Ｓｍａｄ１在牙齿发育过程中的作用,方法制备人牙发育各期标本,免疫组化方法观察Ｓｍａｄ１在人牙胚发育过程中的表达情况。结果：Ｓｍａｄ１在牙胚发育的不同时期均见不同的时表达模式。     

ADAM28在小鼠牙胚发育中的时空表达

目的:研究ADAM28在小鼠牙胚发育中的时空分布。方法:采用免疫组织化学方法和图像分析技术观察ADAM28在小鼠牙胚发育各期的表达分布及差异。结果:ADAM28在牙胚发育各时期均有不同程度的表达。帽状期开始即在口腔上皮及成釉器星网层细胞、基底膜、牙乳头细胞和牙囊细胞表达强阳性,到钟状晚期,成釉细胞、釉基质、上皮根鞘和牙乳头细胞阳性表达;至冠根硬组织发育期,成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘、成牙骨质细胞、牙乳头细胞、牙囊细胞阳性表达。结论:ADAM28作为上皮和间充质间重要的信号分子,参与了从蕾状期到钟状晚期、从基质分泌到硬组织形成的牙冠、牙根形态发生过程,它可能在牙源性间充质细胞的早期形成、增殖与分化启动中发挥重要作用。     

钙结合蛋白Calbindin-D28K在人牙胚发育过程中的表达

研究人牙胚不同发育时期Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ（ＣａＢ）的表达,以期分析ＣａＢ在人牙体硬组织形成过程中的作用,为探明人牙齿矿化过程中经细胞钙转导机制提供实验依据。方法免疫组化ＡＢ染色。结果人牙胚苗,帽状期成釉器无ＣａＢ的表达,钟状早期成釉器的内番细胞及部分牙乳头表面处于分化状态的细胞弱阳性染色;     

小鼠帽状期和钟状早期磨牙牙胚差异表达基因的初探

目的筛选小鼠帽状期(E14.5)和钟状早期(E18.5)磨牙牙胚的差异表达基因。方法分离小鼠E14.5和E18.5磨牙牙胚,采用基因芯片技术检测相关的差异表达基因。结果共得到76条差异表达基因,上调基因71条,下调基因5条。结论 E18.5磨牙牙胚,调控细胞代谢、分化、极性形成酶类,调控免疫应答相关基因,转录、翻译相关基因,信号通路的信号分子、受体以及应激反应相关基因等功能的基因表达都显著上调,而细胞凋亡相关基因、氨基酸代谢激酶等的表达下调。     

新基因mcpr1在小鼠牙胚发育中的时空表达和意义

目的:探讨mcpr1在牙胚发生过程中的可能作用。方法:采用免疫组化LsAB法观察MCPR1在小鼠牙胚发育各个时期的表达分布及其变化情况。结果:MCPR1在小鼠牙胚各个时期均有表达,但各期分布模式有所不同,帽状期开始在成釉器上皮细胞表达,在釉结节内亦呈现强阳性表达,在分化成熟的成牙本质细胞及成釉细胞内呈现出强阳性表达。结论:mcpr1可能通过上皮-间充质之间的信号传递及相关基因的相互调控,参与成釉器的成熟及牙胚的发育。     

人牙本质涎蛋白在人牙胚发育过程中的表达和意义

目的：探讨人牙本质涎蛋白(human dentin sialoprotein，hDSP)在人牙胚发育过程中的表达和意义。方法：用免疫组化方法检测人牙本质涎蛋白在人牙胚不同发育阶段中的表达。结果：hDSP在蕾状期、帽状期釉上皮以及钟状早期内釉上皮有弱阳性表达，钟状中期正在分泌基质的成牙本质细胞、牙本质小管有强阳性表达，钟状晚期，牙本质小管仍有强阳性表达，而成牙本质细胞转为弱阳性表达。前成釉细胞、成釉细胞有一过性表达。前期牙本质始终无阳性表达。牙胚周围骨组织、软骨组织和口腔软组织无阳性表达。结论：提示hDSP可能参与了牙本质的形成。另外前期牙本质阴性表达，表明hDSP蛋白由成牙本质细胞分泌后，可能通过成牙本质细胞突起穿过前期牙本质分泌至矿化前沿，参与牙本质的形成。     

骨形成蛋白-2、4在胎鼠牙胚蕾状期的表达

目的:观察生长因子骨形成蛋白-2、4(BMP-2、4)在牙胚蕾状期的表达,探讨二者的作用及其关系,为牙组织工程研究打下基础。方法:选取14 d SD胎鼠下颌第一磨牙牙胚做石蜡切片,HE染色光镜观察证实牙胚处于鼠胚胎第14天蕾状期后,则取其前后2~3张切片用免疫组化LsAB法检测BMP-2、4在鼠牙胚蕾状期的分布与表达。结果:BMP-4在蕾状期牙上皮和牙间质均有表达;BMP-2在牙上皮有表达而在牙间质表达不明显。结论:BMP-2、4在牙胚蕾状期表达模式相似,但BMP-2的表达比BMP-4晚,反映二者作用各有侧重又相互联系。     

腭裂相关基因MCPR1在大肠杆菌中的融合表达及抗体制备

目的 :MCPR1是我室利用消减杂交技术克隆出来的新基因 ,本研究利用融合蛋白制备MCPR1的多克隆抗体。方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出MCPR1基因蛋白编码序列 ,进一步将该基因片段克隆到中间载体pGEX -T -easy ,再酶切得到MCPR1片段定向克隆到 pGEX -4T -1载体中 ,构建融合表达载体pGEX -4T-MCPR1,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达 ,得到GST -MCPR1融合蛋白 ,进行初步纯化及SDS -PAGE电泳 ,直接割胶 ,将其作为抗原免疫兔子。结果 :成功构建融合表达载体pGEX -4T -MCPR1,得到初步纯化的GST-MCPR1融合蛋白 ,免疫兔子 1个月后 ,获得免疫血清 ,初步纯化得到多克隆抗体。Western印迹分析表明所得到的抗体具有较强的特异性 ,ELISA分析证实其效价为 10 6。结论 :MCPR1多克隆抗体的获得性为在蛋白水平研究新MCPR1的功能提供了实验基础 ,后续实验可以利用免疫分析技术研究MCPR1蛋白与其它蛋白质的相互作用 ,从而为阐明MCPR1在胚胎发育及腭裂形成中所发挥的作用提供实验手段。     

转录调节因子LMO4在牙胚发育中的基因表达

目的观察转录调节因子LMO4在鼠磨牙牙胚形态发生中的基因表达，并与Shh信号分子的基因表达进行比较。方法制备昆明小鼠磨牙形态发育各期标本（E11．5～P1．5），wholemount原位杂交分析LM04 mRNA在鼠胚中的表达与分布。切片原位杂交分析LMO4及Shh mRNA在牙胚中的表达与分布。用免疫组化SP法对增殖细胞核抗原（PCNA）进行定位研究。结果wholemount原位杂交发现，在E11．5，LMO4 mRNA在上下颌突、肢芽、脑、表皮和体节中呈阳性表达。切片原位杂交发现，E13．5～E16．5，LMO4 mRNA分别在牙蕾上皮、成釉器两侧尖部和颈环处呈阳性表达，Shh mRNA表达于釉结；E18．5～P1．5，LMO4 mRNA在成釉细胞层和中间层呈阳性表达。免疫组化染色发现，E13．5～E16．5，部分牙蕾上皮及颈环处细胞PCNA阳性，恰与LMO4基因表达部位重合。结论LMO4在牙胚形态发生中呈时空特异性表达并且局限表达于上皮来源的组织。LMO4与Shh信号分子表达范围邻近，在牙胚发育早期可能调控细胞增殖，晚期可能参与成釉细胞的分化。     

转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的表达和意义

目的：探讨转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达和对牙胚发育的影响。方法：建立小鼠牙胚发育模型,用免疫组织化学检测转化生长因子βⅠ型受体（ＴβＲ－Ⅰ）、Ⅱ型受体（ＴβＲ－Ⅱ）、Ⅲ型受体（ＴβＲ－Ⅲ）在牙胚发育中的表达。结果：转化生长因子βⅠ型受体、Ⅱ型受体在牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状期以及硬组织形成期均有表达,且随着成釉细胞和成牙本质细胞的逐渐成熟,表达增加,其中Ⅰ型受体比Ⅱ型受体表达量多,Ⅲ型受体仅在蕾状期的成釉器上皮和钟状期的内外釉上皮、牙囊有弱表达。结论：转化生长因子β受体在牙胚发育过程中的时空表达与成釉细胞、成牙本质细胞的分化密切相关。