利福平诱导rpoB基因突变活化变青链霉菌66合成放线紫红素

变青链霉菌拥有完整的放线紫红素生物合成基因簇 ,但它通常并不合成这一抗生素。引入特定的rpoB基因 ,不仅产生了对利福平的抗性 ,同时活化了放线紫红素的合成 ,表明由该基因编码的RNA聚合酶 β亚基因在抗生素的生物合成调控中起十分重要的作用。DNA顺序分析揭示出在rpoB基因上的四种不同突变类型 ,均不同程度地活化变青链霉菌合成放线紫红素 ,表明利福平具有与链霉素类似的功能 ,即活化或加强链霉菌合成抗生素或酶的水平。     

文摘

13-40绿色产色链霉菌的Bialaphos生物合成基因:克隆、种间表达以及与吸水链霉菌合成基因的比较绿色产色链霉菌和吸水链霉菌是从世界上不同地区分离到的,在分类学上属于不同类群,但两者产生同一种抗生素Bialaphos。在变青链霉菌中克隆绿色产色链霉菌的Bialaphos抗性基因bar.以此做选择标记分离Bialaphos产生基因。实验证实克隆到的bar     

北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis 2488)启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自北里链霉菌SK2488的启动子和柱晶白霉素抗性基因,得到三个转化子其中转化子变青链霉菌TK24(pRL1)中重组质粒插入片段约为10kb,其外源启动活性和柱晶白霉素抗性较低;转化子变青链霉菌TK24(pRL2)中重组质粒插入片段较小,但具有高活性的外源启动子,并有较高的柱晶白霉素抗性;转化子变青链霉菌TK24(pRLX)中未分离得到重组质粒,但它同样具有区别于受体的对新霉素和柱晶白霉素的抗性,而且它在R_2YE平板上能抑制其它转化子生长,其发酵液经薄层层分析发现有不同于供体和受体的新斑点,发酵液经高压液相分析发现有一个吸收峰。但三个转化株发酵液均无抗菌活性,将重组质粒pRL1和pRL2再转化变青链霉菌TK24,抗性稳定。     

通过灰色链霉菌原生质体再生提高卡那霉素抗性的机制——Ⅰ.指导高水平氨基糖苷3-N-乙酰转移酶活性基因片段的克隆

由于链霉基因技术的发展,使我们能够克隆和分析结构以及抗生素生物合成基因与抗性基因的调节,相继发现了一些簇集在一起的抗生素生物合成基因和抗性基因。并且证实了一些基因的启动区和二种形式的RNA聚合酶全酶。在分别丧失生产链霉素(SM)和Istamycin(IS)能量的灰色链霉菌和S.tenjimariensis两个突变株之间进行的种间原生质体融合而产生抗生素抗性的研究过程中,Yama Shita等发现灰色链霉菌原生质体再生的结果出现了显著增强卡那链霉(KM)抗性的克隆。没有经过原生质体再生的灰色链霉菌对5μg/mlKM敏感,抗性克隆后可在500～1000μg/ml KM的情况下生长。尽管人们知道链霉菌原生质体再生可引起各种各样的表     

链霉菌启动子的克隆和抗生素的产生

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自金霉素链霉菌UK81的启动子,得到了三个转化子。其中转化子变青链霉菌TK24(pTA1)是含高活性外源启动子的重组子。而变青链霉菌TK24(pTA5)和变青链霉菌TK24(pTA7)中的外源启动子活性很低,但变青链霉菌TK24(pTA7)产生了新抗生素。其抗菌谱与供体金霉素链霉菌UK81的不同,当重组质粒,pTA7再转化金霉素链霉菌UK81时,得到的再转化子的抗菌谱仍与金霉素链霉菌UK81相同,但再转化子的抗生素产生被促进。经高压电泳和薄层层析表明,变青链霉菌TK24(pTA7)产生的胞内抗生物质为两种成份。金霉素链霉菌UK81(pTA7)和金霉素链霉菌UK81产生的抗生素成份相同而与变青链霉菌TK24(pTA7)产生的不同。实验得到的三个重组质粒pTA1、pTA5和pTA7上的插入片段大小分别为2.7kb、3.75kb和2.2kb。     

灰色链霉菌链霉素抗性基因的克隆及其在变青链霉菌中的表达

用质粒 pIJ702作载体(tsr~R,str~S,mel~ ),变青链霉菌1326(tsr~S,str~S)作为受体,克隆来自供体灰色链霉菌8500(str~R,tsr~S)的链霉素抗性基因。经提取和纯化后,供体染色体 DNA 用 Barn HI 完全酶切,质粒 pIJ 702DNA 用 BglII 酶切,二者在 T4DNA 连接酶     

链霉菌启动子的克隆和抗生物质的产生

用启动子探针质粒pIJ 486作载体,变青链霉菌TK 24作受体,克隆来自金色链霉菌UK 81的启动子,得到了3个转化子。其中变青链霉菌TK 24(pTA 1)是含高活性外     

克隆异青霉素N合成酶的纯化与特性

在丝状真菌和链霉菌中,异青霉素N合成酶(简称IPS)是在青霉素和头孢菌素的生物合成中负责将LLD-氨基己二酸-半胱氨酸-缬氨酸(简称ACV)转化成异青霉素N的酶.IPS已经从产黄顶孢霉,产黄青霉和棒状链霉菌中获得提纯并表明具有广泛的底物特异性.产黄顶孢霉和产黄青霉的IPS基因已经在大肠杆菌RV308中被克隆和表达.本文报道克隆产黄顶孢霉IPS的纯化,N-末端序列,动力学及底物特异性的研究.     

头状链霉菌中丝裂霉素C抗性基因mcrAB的克隆及其作用研究

丝裂霉素 C属于苯醌类抗肿瘤抗生素 ,在生物体内作为前药 ,经酶催化还原后可阻碍 DNA的复制。我们从头状链霉菌中克隆出丝裂霉素 C抗性基因 mcr AB,测序结果与另一丝裂霉素产生菌—淡紫灰链霉菌的 mcr AB基因序列进行了比较 ,结果表明此序列是高度保守的。同时还构建了带有 mcr AB基因的质粒载体 p YG2 0 6 ,将 p YG2 0 6用原生质体转化法导入变青链霉菌 TK6 4 ,并在此菌中表达 ,大大提高了该菌对丝裂霉素 C的抗性。进一步研究表明 :在有氧条件下 ,mcr AB基因表达的蛋白可抑制菌体对丝裂霉素 C的转化作用。     

抗生素产生菌基因克隆的新进展

虽然顶头孢的转化作用已经得到证明,然而抗生素产生菌的基因克隆技术基本上仍局限于链霉菌属。有关克隆链霉菌基因的许多基础研究已有评述,并且出版了天蓝色链霉菌和变青链霉菌分子生物学技术的实验手册。最新进展还包括原生质体形成、再生和融合。目前,原生质体再生是在铺有渗透稳定培养基的琼脂培养皿上完成的。尽管在液体中有利于原生质体再生,但至今并未实行。     

透明颤菌血红蛋白基因在链霉菌中的克隆和表达

以质粒ｐＩＪ７０２和ｐＩＪ６９９为载体，构建了两个带有透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌａ）血红蛋白（ＶＨｂ）基因（Ｖｇｂ）的大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒并转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１、变青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４及蒽环类抗生素阿柔比星（阿克拉菌素）产生菌——加利利链霉菌（Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ）ＡＴＣＣ３１１３３，经ＣＯ结合差光谱法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析表明Ｖｇｂ在大肠杆菌和链霉菌中得到表达。通过改变培养条件研究溶氧对Ｖｇｂ表达的影响，结果表明在低溶氧的情况下，ＶＨｂ表达量增加。同时发现，在低氧浓度时，ＶＨｂ的表达有利于链霉菌菌体的生长，其菌体生长量高于同样条件下的对照菌株（Ｖｇｂ－）１７％～２９％。     

链霉菌RNA聚合酶的异质性和启动子的多样性

链霉菌是革兰阳性好氧土壤细菌,其生活周期涉及到一个复杂的形态分化过程,包括孢子发芽、营养菌丝生成、气生菌丝形成和孢子生长.链霉菌的基因组大约为8×10~6~1×10~7个碱基对,相当于大肠杆菌的2倍多,其DNA含有异常高的GC比(约为73%),并有证据表明,染色体的线性形式在链霉菌中很普遍.在链霉菌中,从形态分化到次级代谢过程无不为一个复杂的、常常是相互偶联的多层次调控系统所支配.这些调控层次包括:启动子和RNA鄹合酶的多样性,阻遏作用,活化作用,感受器/响应器调控系统,ppGpp系统,调控tRNA系统,以及被誉为细菌激素的丁羧内酯类化合物系统.许多异源基因,包括人的白细胞介素2(IL-2),牛的生长激素,大肠杆菌木糖异构酶基因等,都可在链霉菌中获得表达.高活性启动子的存在往往是外源基因表达的关键.因而,了解有关链霉菌启动子结构与基因表达的关系,对于构建链霉菌分泌表达载体相当重要.     

抗生素产生菌链霉菌基因表达的调节

Jacob和Monad对大肠杆菌K12菌株Lac操纵子的杰出研究距今已二十五年了。这些年来,众多天赋的科学家们已把这个相当简单的生物变成了了解基因结构和表达的微观世界。直到最近还证明“热休克”反应时所开启的那些基因的分化表达是依赖于迄今仍未知的一种RNA聚合酶。不过,在许多方面还会取得一些新进展。尽管如此,对在遗传能力上超出大肠杆菌的其它一些细菌也有必要进行广泛而深入的研究,链霉菌就属于这类细菌的范畴。链霉菌是革蓝氏阳性细菌,有两个显著的特征,一是形态发育的复杂性,包括了产生分枝菌丝和形成孢子。二     

质粒间重组后弗氏链霉菌的新霉素磷酸转移酶基因在大肠杆菌内的表达

体外重组和分子克隆的技术促进了一种微生物的基因在另一个种系发生的远缘种内表达的研究。例如,已证实不同的革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和环状芽孢杆菌)的基因在大肠杆菌内表达。已构建能在链霉菌和大肠杆菌中复制的双功能复制子;链霉菌DNA     

dauW基因对柔红霉素产量的影响

报道了先前克隆的柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)dauW基因的过表达和阻断对柔红霉素产量的影响.通过原生质体融合将dauW表达质粒导入天蓝淡红链霉菌DM,所得重组菌DM-W1的柔红霉素产量无明显提高;而通过大肠杆菌-链霉菌接合转移获得的发生同源重组单交换的dauW阻断突变株DM-W2,柔红霉素产量达(192.0±61.6)μg/ml,且遗传稳定性好.试验结果表明,对dauW基因的阻断突变能明显提高柔红霉素的发酵单位.     

链霉菌的次级代谢调节

链霉菌的次级代谢受到种类繁多的小分子量物质和调节蛋白的调控。我们将叙述:1)在天蓝色链霉菌A3(2)中能增强afsB基因对放线紫红素产量起正效应的afsC基因;2)A因子,这是在灰色链霉菌中把次级代谢与细胞分化相联的“微生物激素”;3)在暗黄绿链霉菌(S.fulvoviridis)克隆的碳青霉烯生物合成基因簇中,控制碳青霉烯生产和孢子形成的基因鉴定。天蓝色链霉菌A3(2)中afsB和afsC基因天蓝包链霉菌A3(2)的afsB基因是一个多向性的调节基因,是菌体生物合成A因子(2-异辛酸-3R-羟甲基-γ-丁内酯)、呈色的抗生素放线紫红素(actinorhodin)和十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)所必需     

逆转录PCR（RT-PCR）实验操作要点

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。以RNA为模板,首先在依赖于RNA的DNA聚合酶的催化作用下体外合成cDNA的第一条链。以此条cDNA链为模板,又可继续进行PCR。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA．要得到理想的结果．关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。而确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染,关键是要做好实验前的准备,注意实验操作的一些细节。     

T7启动子介导体外构建Nucleostem in特异性短发夹状干扰RNA

目的体外构建合成针对Nuc leostem in(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNA i)为手段的白血病基因治疗可行性。方法从Nuc leostem in基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3′端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5′-UCUCUUGAA-3′作为Loop环。以23个碱基的5-′GGATC-CTAATACGACTCACTATA-3′作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5′端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5′端带有AA,共72个碱基。在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polym erase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果。结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24μmol.L-1和3.35μmol.L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%。结论体外成功构建和合成了两条针对Nu-c leostem in基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变。所合成的shR-NA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具。     

构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造

以容纳DNA大片段的柯斯质粒Supercos-1为载体.构建了除虫链霉菌的基因组文库.对约1000个柯斯质粒上插入片段的两端进行测序,并利用全基因组序列的信息,构建了覆盖约91%基因组的有序排列的柯斯文库.利用入λ-Red高效DNA重组和大肠埃希菌-链霉菌接合转移技术,建立了除虫链霉菌的基因组遗传操作系统.运用该系统可以在除虫链霉菌工业菌株中进行高效、精确的基因敲除工作和连续的基因缺失研究,获得可以用来生产多拉菌素的工程菌株.     

链霉菌分子遗传学研究的新进展

链霉菌的基因表达 (一)RNA多聚酶天蓝色链霉菌(S. coelicolor)A 3(2)和抗生链霉菌(S. antibiotieus)的RNA多聚酶类似于其它原核生物,其特征是有ββ′α_2亚基结构,可是在已经发表的研究中还没有清楚地鉴定出sigma亚基。该酶对利福平敏感,尽管在不同菌株中敏感程度有所不同,并且已在天蓝色链霉菌A 3(2)中得到一株RNA多聚酶发生改变的利福平抗性突变株(这些Rif~R突变的位置紧靠于strA座位)。