日本血吸虫钙网蛋白基因的克隆、表达及鉴定

目的 为了寻找日本血吸虫病新的免疫学候选分子,克隆日本血吸虫钙网蛋白(calreticulin,CRT)编码基因,并进行表达、鉴定.方法 以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjCRT编码基因,并与pGEM-T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与表达载体pET28a(+)连接,PCR和双酶切鉴定后测序.IPTG诱导表达重组质粒pET28a-SjCRT,进行SDS变性蛋白质电泳和Western-blot分析,用亲和层析纯化获得重组蛋白.结果 成功地构建了重组质粒pET28a-SjCRT,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blotting分析表明,该重组蛋白能被血吸虫感染小鼠阳性血清识别.亲和层析纯化获得SjCRT重组蛋白.结论 重组质粒SjCRT的构建和重组蛋白的表达和纯化,为进一步探讨其在血吸虫病疫苗和诊断中的应用奠定了基础.     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

日本血吸虫tetraspanins胞外环2编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫（中国大陆株）tetraspanins胞外环2（EC-2）编码基因（Sj-tsp-2）。方法在日本血吸虫基因组中筛选获得与曼氏血吸虫tetraspanins基因胞外环2结构域序列同源的片段，经过一定修饰，采用全基因合成方式获得目的基因片段，构建重组质粒pET-32a-Sj-tsp-2，并转化至BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达，在非变性条件下亲和纯化融合蛋白。结果通过核苷酸测序证实重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明，融合蛋白和目的肽段与预计太小基本一致。Western blotting结果说明，该融合蛋白具有良好的免疫原性。结论本实验成功表达了日本血吸虫Sj-tsp-2基因，并纯化获得其融合蛋白，为进行动物保护性实验奠定了基础。     

重组日本血吸虫特异性IgE相关蛋白的纯化及免疫学活性鉴定

目的　纯化重组日本血吸虫特异性IgE抗体相关蛋白和鉴定其免疫原性。　方法　大量表达Sj43B/pGEX 6p 1 /BL2 1重组克隆菌 ,超声粉碎后离心获得融合表达的重组蛋白包涵体。经TNMFX缓冲液分步洗涤后 ,将包涵体溶解液经FPLC分离 ,获得重组融合蛋白组分 ,再经巯基二硫键转换复性后 ,用于免疫小鼠获得抗血清 ,分别用dot ELISA法和Westernblotting法对融合蛋白引起的特异性血清抗体同型反应进行鉴定。　 结果　分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分 ,FPLC分离可获得高纯度重组蛋白。用复性后的重组融合蛋白免疫小鼠 ,其中目的蛋白可引起特异性IgE抗体反应 ,而担体蛋白 2 6kDaGST不引起特异性IgE应答 ,可引起特异性IgG抗体反应 ,目的蛋白则否。　结论　重组质粒Sj43B/pGEX 6p 1表达的融合蛋白 ,其目的蛋白部分免疫小鼠可产生特异性IgE抗体。     

日本血吸虫表膜蛋白Tetraspanin 2-A基因的克隆、 表达与鉴定

目的 扩增并表达日本血吸虫表膜蛋白(SjTsp2-A)基因 SjTsp2。 方法 根据与曼氏血吸虫表膜蛋白 SmT-sp2 基因同源的SjTsp2 序列(编号为AY810722)设计引物, 体外扩增目的蛋白基因,并将其亚克隆入原核表达载体pET28a, 转化至大肠埃希菌 (E. coli) BL21株, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达, 用纯化的重组蛋白免疫小鼠, ELISA检测其血清抗体效价, 蛋白质印迹 (Western blotting)分析鉴定其免疫反应性。 结果 PCR扩增获得SjTsp2基因大环核苷酸序列为 228 bp, 与曼氏血吸虫表膜蛋白(SmTsp2)的氨基酸序列同源性为 52%。 SjTsp2基因亚克隆入pET28a并可溶性表达, 免疫小鼠可产生高滴度(最高1 ∶ 32 000)特异性抗体。Western blotting分析结果表明, 纯化的SjTsp2-A蛋白能被疫区居民血吸虫抗体阳性者血清、急性及慢性血吸虫病患者血清识别,与健康人血清无反应。 结论 日本血吸虫表膜蛋白基因SjTsp2在体外获得表达, 其表达蛋白具有一定的抗原性。     

日本血吸虫腺苷酸激酶基因的表达及其重组蛋白免疫反应性的评价

目的　将亚克隆入 pET3 2a( +)质粒的日本血吸虫腺苷酸激酶 (adenylatekinase ,AK )基因进行表达及蛋白纯化 ,并对表达产物的免疫反应性进行评价。　方法　将重组表达质粒 pET3 2a( +) AK转入宿主菌大肠埃希菌BL2 1,异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达后超声裂菌 ,离心 ,取上清进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE) ;将SDS PAGE后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上 ,分别用 6 组氨酸 ( 6 His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6wk的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清为一抗进行蛋白质印迹试验 (Westernblotting) ;用金属Ni螯合物亲和层析树脂 (Ni NTA)层析柱纯化目标蛋白 ;以纯化后的融合蛋白为包被抗原 ,酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测正常兔血清和血吸虫感染兔血清。　结果　重组菌用IPTG诱导表达后进行SDS PAGE ,于相对分子质量 (Mr) 40 0 0 0处见一特异表达带 ,与预期表达的融合蛋白大小相符 ;Western印迹分析显示该重组的融合蛋白带有预期的 6 His基团 ,且能与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清发生特异性反应 ;ELISA结果显示纯化的重组AK蛋白可以特异识别血吸虫感染兔血清。　结论　AK基因在工程菌中以可溶性融合蛋白的形式得到表达 ,该重组蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有特异的免疫反应性。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

日本血吸虫四跨膜蛋白6编码基因的克隆、表达与鉴定

目的 为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫Sj-Tsp6样融合蛋白。 方法 设计特异性引物,PCR法扩增出日本血吸虫Sj-Tsp6样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入pET28a(+)表达载体,经酶切、测序证实正确后,转化入大肠杆菌BL21中,并用IPTG对该重组菌诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot方法观察表达结果。 结果 PCR法扩增出一条大小约为702bp大小的Sj-Tsp6样蛋白的DNA片断,将目的基因转入表达质粒pET28a(+),经SDS-PAGE可见一条约28kDa大小的带有HIS标签的融合蛋白条带,此蛋白可被血吸虫病兔血清所识别。 结论 本实验成功克隆日本血吸虫Sj-Tsp6 样抗原的编码基因,并在原核细胞中进行表达,为进一步验证其免疫诊断价值奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

日本血吸虫T2核酸酶的原核表达及活性分析

目的 构建日本血吸虫T2核酸酶表达载体,并进行体外表达和酶活性分析。方法 从日本血吸虫基因组数据库中找到与曼氏血吸虫虫卵抗原Omega-1同源性最高的蛋白AY814845,设计引物并通过PCR技术扩增得到该基因,将其成熟编码区连入pET32a表达载体,转化大肠杆菌并用IPTG诱导其表达,最后对表达产物的核酸酶活性进行分析。结果 成功的构建了日本血吸虫T2核酸酶的表达载体,其编码区能够在大肠杆菌中表达,且表达产物具有一定的核酸酶活性。结论 从体外扩增了日本血吸虫T2核酸酶AY814845,明确其表达产物具有核酸酶活性,为今后深入研究该蛋白的功能打下了基础。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

肺炎支原体P30蛋白结构基因的克隆和表达研究

目的构建完整的肺炎支原体粘附分子P30蛋白结构基因原核表达质粒并进行表达。方法用引物修饰法将P30基因中唯一的“UGA”码突变为“UGG”,PCR扩增出P30蛋白编码基因后定向克隆入PET32a(+)质粒,构建PET32a(+)/P30重组体,再转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达外源基因。结果成功扩增出不含“UGA”码的P30基因;经双向测序结果与GenBank注录的P30基因序列一致;SDS-PAGE显示P30基因在BL21中得到完整表达。结论获得含有完整P30基因的重组克隆株并在大肠杆菌中表达了完整的重组蛋白,为进一步探讨P30基因及其编码产物功能打下了基础。     

粉尘螨Ⅰ类变应原的cDNA克隆测序及亚克隆

目的　获得粉尘螨I类变应原(Derf1)cDNA克隆及亚克隆,并进行测序。　方法　设计合成引物,从粉尘螨体内提取RNA,经逆转录聚合酶链反应(RTPCR)获得cDNA,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD18T,转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序,将PCR筛检阳性重组子及pET32a(+)表达载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切,连接转化至E.coli感受态细胞JM10 9中过夜培养,挑选菌落进行酶切鉴定。　结果　从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf1基因,获得pET32a(+)Derf1亚克隆,酶切产物的大小与预期相符。　结论　对粉尘螨Derf1基因进行体外扩增并获得pET32a(+)Derf1亚克隆。     

JC病毒小包膜蛋白VP2抗原及鼠多克隆抗体的制备

目的 构建JC病毒小包膜蛋白VP2的原核表达载体,表达纯化VP2蛋白,并制备其抗体.方法 用PCR方法从患者脑脊液中扩增JC病毒小包膜蛋白VP2基因,测序正确后克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21大肠埃希菌,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该蛋白并纯化.纯化的VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠多克隆抗体.结果 将pET-32a(+)-VP2重组表达载体分别转化BL21大肠埃希菌,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为58.5×10~3左右的重组融合VP2蛋白.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示,IPTG诱导6～10 h重组蛋白表达水平较高.Western印迹证实其具有良好的抗原性,且免疫BALB/c小鼠后成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET-32a(+)-VP2并获得纯化VP2融合蛋白,并制备JC病毒小包膜蛋白VP2抗体,为进一步对VP2蛋白的功能及JC病毒流行病学调查等研究奠定了坚实的基础.     

JC病毒t抗原的融合蛋白表达及抗体制备

目的 构建JC病毒t抗原的原核融合蛋白表达载体,表达并纯化该融合蛋白.方法 采用PCR方法 从患者脑脊液中扩增JC病毒t抗原,测序正确后再克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-t表达重组体,并诱导表达t抗原融合蛋白.大量制备该融合蛋白并以镍柱亲和层析纯化.然后以纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果pET32a(+)-t表达出相对分子质量为41 000左右的重组蛋白.十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,异丙基-βD-硫代半乳糖苷诱导后3.5～20.0 h融合蛋白均高水平表达.Western印迹证实具有良好的抗原性,免疫BALB/c小鼠后,成功制备了鼠多克隆抗体.结论 成功构建原核表达载体pET32a(+)-t,表达纯化t抗原融合蛋白,成功制备了JC病毒小包膜蛋白t的抗体,为进一步流行病学调查及该基因的功能研究奠定了基础.     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

副溶血弧菌tlh基因的克隆及序列分析

目的　构建副溶血弧菌不耐热性溶血毒素 (thermolabilehemolysin ,TLH)tlh基因重组质粒。方法　根据已知GenBank中的tlh基因序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从副溶血弧菌基因组DNA中扩增编码TLH的基因片段 ,克隆至pET32a+ 质粒 ,转化大肠杆菌DH5感受态细胞 ,经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序。结果　tlh基因体外扩增产物大小约1 30 0bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。 结论　在国内首次克隆了副溶血弧菌tlh基因 ,为研究TLH的功能和探讨TLH作为作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础     

轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将轮状病毒（Rotavirus RV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌(Enteotoxigenic Escherichia coli ETEC)热稳定肠毒素（Heat-stable enteotoxin Escherichia coli ST)基因融合，插入原核表达质粒pET-28a( )中，经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4-st片段克隆入PET－28a( ),而且具有正确的读码框和方向性，正确构建了VP4－ST的融合表达载体pET28-VP4-ST。表达质粒转化受体菌BL21（DE3）plysS，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS－PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明：表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大小约40．2kDa，表达的蛋白量占菌体总蛋白的13．048％。     

嗜肺军团菌flaA基因DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建flaA基因的DNA疫苗,观察其对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-flaA上切下flaA基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-flaA。将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA3.1-flaA实验组肌肉接种pcDNA3.1-flaA质粒100μg,2w后加强免疫一次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和100μg空质粒,加强免疫后3w小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌Lp1菌液进行攻击感染,感染4w后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flaA,攻击感染实验表明,pcDNA3.1-flaA免疫组肺组织带菌量显著少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.05),且肺组织病理变化症状较pcDNA3.1对照组和生理盐水对照组的肺轻微。结论由flaA基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。