腺相关病毒与人α1干扰素基因重组体的构建

目的 构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因重组体。方法 用多聚酶链反应(PCR)方法扩增获得hIFNα1基因；以T-A克隆方法将PCR扩增hIFNα1基因亚克隆到PCR2，1质粒中，产生PCR2．1—hIFNα1；用EcoRI酶切PCR2．1—hIFNα1，后回收hIFNα1基因片断，将此片断连接到pWP8A的EcoRI位点上，构建重组体pWP8A—hIFNα1；pWP8A—hIFNα1转化JM109大肠杆菌扩增，hIFNα1基因经测序鉴定符合Genebank中hIFNα1序列，并用BanH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向。结果 经MR扩增获得567bp hIFNα1基因；构建重组体pWP8A—hIFNα1，经测序证实pWP8A—hIFNα1中的hIFNα1与Genebank中hIFNα1序列相同，用BamH I酶和Xbal I酶双酶切鉴定hIFNα1基因插入方向正确的重组体pWP8A—hIFNα1。结论 成功构建腺相关病毒载体(pWP8A)与人α1干扰素(hIFNα1)基因的重组体。     

携带抑癌基因的重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装滴定方法探讨

目的　构建携带多肿瘤抑制基因p16 (mts 1)及抑癌基因p2 1WAF1的腺相关病毒 (AAV)载体 ,通过病毒包装、纯化及滴定 ,获得高纯度高感染性的病毒液 ,为进行肝癌基因治疗的实验研究奠定基础。方法　以p16cDNA及p2 1cDNA全长为目的基因 ,构建AAV载体prAAV AFP p16 ,prAAV AFP p2 1,prAAV CMV p16及prAAV CMV p2 1。其中前两种载体能在人肝癌细胞中特异表达目的基因。应用脂质体将重组载体与辅助质粒PspRC72、腺病毒粘粒共转染包装细胞 ,2d后感染野生型腺病毒 ,至细胞裂解病变明显时收获。纯化后用聚合酶链反应法扩增倍比稀释后病毒液内的甲胎球蛋白或巨细胞病毒启动子DNA ,进行病毒DNA颗粒滴度测定。然后用重组腺相关病毒与腺病毒 (MOI均为 10 )共感染C12细胞 ,至细胞裂解病变明显时再收获。结果　重组载体经酶切鉴定测序证实。 2 93细胞、C12细胞包装病毒效果良好 ,病毒颗粒滴度介于 10 13 ～ 10 14 个 /ml之间。携带GFP的感染性AAV滴度为 5× 10 10 个 /ml。电镜下病毒呈小圆形空斑状 ,直径 2 5～ 30nm。MOI值 10 0时 ,rAAV AFP GFP病毒感染肝癌细胞的阳性率达 70 % ,为携带目的基因的AAV病毒用于肝癌细胞的促凋亡研究提供了定量指标。结论　成功构建了AAV载体 ,探讨了病毒包装方法 ,即第一次转染成功后 ,     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装

目的探讨构建重组人SERCA2a基因9型腺相关病毒载体和病毒包装的方法,并包装出rAAV9-hSERCA2a-EGFP。方法根据细菌内同源重组的方法使用腺相关病毒包装系统,将hSERCA2a基因克隆到腺相关病毒载体中,与腺相关病毒包装质粒pAAV pHelper发生重组,通过脂质体共转染人胚肾293(HEK293)细胞,产生重组腺相关病毒,通过酶切鉴定和DNA测序鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定(采用荧光滴度检测法)。结果酶切鉴定和DNA测序证明重组腺相关病毒载体rAAV9-hSERCA2a-EGFP构建成功,PCR鉴定可见到阳性扩增条带,rAAV9-hSERCA2a-EGFP滴度高达1×1012 vg(virus genomes,vg)/mL。结论本方法成功构建和包装滴度为1×1012 vg/mL携带hSERCA2a基因的rAAV9-hSERCA2a-EGFP。     

携带CML28基因的2型重组腺相关病毒的构建及体外转染树突状细胞

 目的 构建携带肿瘤抗原CML28基因的2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV2/CML28）,检测其体外转染人树突状细胞（dendritic cells,DCs）后对DCs的影响和目的基因CML28的表达。方法 将CML28基因克隆到2型重组腺相关病毒载体系统（AAV Helper-Free System）中的真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP,将酶切和DNA测序鉴定后的重组表达质粒pAAV-CML28-hrGFP与AAV Helper-Free System 中的病毒包装辅助质粒pAAV-RC和pHelper以磷酸钙法共转染AAV-293细胞,制备携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28。rAAV2/CML28转染体外培养的DCs,RT-PCR法检测CML28的表达,流式细胞术检测DCs的表面分子和rAAV2/CML28转染DCs的效率。结果 流式细胞术证实构建并包装了rAAV2/CML28,该病毒对DCs的转染效率接近30%,病毒转染DCs检测到CML28的表达以及高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86表达。结论 成功构建了携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28,该病毒介导目的基因在DCs内表达,DCs的成熟没有因病毒转染受到不良影响,为应用CML28转基因DCs诱导CML28特异性抗肿瘤免疫研究奠定了基础。     

人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒的构建及功能鉴定

目的:构建人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒,并对其进行结构和功能鉴定.方法:对目的基因质粒pUC57-carabin和载体质粒pAAV9-IRES-ZsGreen进行EcoRI+XhoI双酶切,在T4DNA Ligase作用下连接酶切产物,在JM109感受态细胞中筛选pAAV9-carabin-IRES-...     

重组腺相关病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因在人／鼠结肠癌上皮细胞中的表达

目的：探讨重组腺相关病毒／人凝血因子Ⅸ基因（rAAV-2／hFⅨ）在人／鼠结肠癌上皮细胞（SW480／C26细胞株）中的表达。方法：重组腺相关病毒／绿色荧光蛋白（rAAV-2／GFP）感染SW480／C26细胞，在荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。rAAV-2／hFⅨ感染SW480／C26细胞，检测hFⅨ基因、FⅨAg量及hFⅨ活性的表达。结果：SW480细胞株／C26细胞株GFP48hr阳性率分别为（57．0±8．5）％和（48．0±5．7）％；转导组14d和21d均可见外源hFⅨ的cDNA片断。SW480细胞转导了rAAV-2／hFⅨ后在第2天和第21天ELISA法测hFⅨ抗原量分别为（98．0±4．3）和（30．9±6．5）ng·10^6cell^-1·24h^-1。未转导组为（2．7±0．1）ng·10^6cell^-1·24h^-1。C26细胞转导了rAAV-2／hFⅨ后在第2天测hFⅨ抗原量为（78±5．12）ng·10^6cell^-1·24h^-1。未转导组为（2．9±0．1）ng·10^6cell^-1·24h^-1。hFⅨ活性与hFⅨ抗原浓度明显相关。较对照组亦显著增高。结论：rAAV-2／GFP能有效地转导SW480／C26细胞。rAAV-2／hFⅨ能有效地转导SW480／C26细胞并表达具有凝血活性的功能蛋白hFⅨ。     

hTRX-PR39重组腺相关病毒载体的构建

目的 探讨hTRX-PR39融合基因在脑缺血疾病中的治疗作用。方法 将已经构建好的hTRX-PR39融合基因插入到具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad,三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体, 收集病毒, 斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果 成功构建重组腺相关病毒质粒pSSCMV/ hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×(1012~1013)PFU/mL。结论 成功构建pSSCMV/ hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并包装较高浓度的重组病毒。     

携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体的构建及初步应用

目的:为构建携带受Tet-On以及VEGF启动子调控自杀基因的重组腺相关病毒载体。方法:用PCR方法扩增VEGF启动子,将其插入pAAV/TRE/HSVtk/Tet-On,形成重组载体pAAV/VEGF/ TRE/HSVtk/Tet-On质粒。进行病毒包装后得到了AAV/VEGF/TRE/HSVtk/Tet-On重组腺相关病毒。用重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺HBL-100细胞,用MTT法及RT-PCR检测在Dox诱导下,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞和HBL-100细胞的杀伤作用以及HSVtk基因在MCF-7细胞内的表达情况。结果:在rAAV+Dox+GCV组,GCV对rAAV感染的MCF-7细胞的杀伤作用明显高于rAAV+Dox组,rAAV+Dox组以及HBL-100组,并且RT-PCR结果显示经Dox诱导HSVtk表达较明显。结论:成功构建了携带双调控自杀基因的重组腺相关病毒载体,该病毒载体能有效的感染乳腺癌细胞MCF-7,并能联合GCV治疗,抑制肿瘤细胞生长,而且具有靶向性。     

携带血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒的制备

目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)。方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定。利用Lipofectamine将pSNAV-rHO-1转染BHK-21细胞,G418筛选得到表达外源基因的细胞系BHK/rHO-1。用具有能表达Rap和Cap及包装重组AAV功能的一种重组单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2分别感染这株细胞系后收获并纯化病毒,DNA斑点杂交检测重组病毒滴度。结果:扩增了rHO-1基因,测序证实与GenBank中的一致,病毒滴度为1.5×1015v.g/L。结论:成功获得了高滴度、高纯度的重组AAV-rHO-1,这为以后心血管系统疾病的基因治疗研究奠定了基础。     

极低密度脂蛋白受体亚型与脂蛋白的结合效应及其摄取能力的差异

目的 探讨人极低密度脂蛋白受体（VLDLR）不同亚型与配体的结合效应及其摄取能力的差异，明确其在脂蛋白代谢和泡沫细胞形成中的作用。方法 应用基因重组技术获得分别稳定表达全长VLDLR（I型）和（Mink糖链区缺失的VLDLR（Ⅱ型）的ldlA7细胞株。核素标记VLDLR的天然配体VLDL、β-VLDL以观察配体结合能力；以VLDL温育细胞，检测细胞内脂质含量，油红O染色法观察胞内脂质堆积及泡沫细胞形成情况。结果 实验发现，稳定表达Ⅰ型VLDLR的ldl—A7细胞表面结合^125I-VLDL和^125I-β—VLDL的量与胞内甘油三酯和总胆固醇的含量均明显高于表达Ⅱ型VLDLR的ldl—A7细胞，泡沫细胞形成显著。结论Ⅰ型VLDLR与VLDL、β-VLDL的结合和摄取能力明显高于Ⅱ型VLDLR，泡沫细胞形成过程中Ⅰ型VLDLR发挥着重要作用。     

重组腺相关病毒介导的nm23H1载体的构建及鉴定

目的对载有肿瘤转移抑制基因nm23H1的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定。方法用基因重组的方法构建含全长nm23H1的重组腺相关病毒骨架质粒，利用磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞293细胞中，分别合成AAV-nm23H1和AAV—Laz，经PCR，DNA测序，酶切鉴定，用斑点杂交法测定重组病毒的滴度。并用重组病毒感染卵巢癌细胞测定其转染效率。结果成功构建并鉴定nm23H1，梯度均为10^10病毒分子／ml，转染效率为70％。结论构建AAV—nm23H1为临床治疗肿瘤转移提供了新的手段。     

浙东地区汉族人群sLOX-1浓度与LOX-1基因多态性相关性研究

目的 观察血浆中sLOX-1浓度是否和LOX-1基因多态性相关.方法 采用酶联免疫吸附法测定354例接受冠状动脉造影的浙东地区汉族人群住院患者血清中sLOX-1的浓度,并采用Tm-shift基因分型方法对G501C和3'UTR-C/T等位基因型进行检测,其中包括43例急性心肌梗死、86例不稳定型心绞痛、89例稳定型心绞痛和136例经冠状动脉造影排除冠心病的患者.结果 3 'UTR-C/T位点TT,TC,CC基因型分别为5.4％,37.3％,57.3％,501G/C位点CC,GC,GG基因型分别为5.4％,31.9％,62.7％,3'UTR-C/T TT,TC,CC 3组sLOX-1浓度分别为160.0 ±56.1,132.7±52.0,128.9±58.0pg/ml,501G/C CC,GC,GG 3组sLOX-1浓度分别为134.0±55.2,127.2±50.8,134.2士58.7pg/ml.不同基因型患者sLOX-1浓度各组间没有显著性差异,在各亚组间也没有差异.结论 浙东地区汉族人群sLOX-1浓度和LOX-1基因多态性无相关性.     

Function and Significance of Very Low Density Lipoprotein Receptor Subtype Ⅱ

Summary: To explore the functions of very low density lipoprotein receptor (VLDL-R) subtype II in lipoprotein metabolism and foam cells formation, the recombinant plasmid with the two subtypes cDNA was constructed respectively, the ldl-A7 cell lines were transfected and two cell lines expressing VLDL-R were obtained: one stably expressing the VLDLR with the O-linked sugar region (type I VLDLR) and the other without the O-linked sugar region (type II VLDLR). In the study on binding of VLDLR to their nuclein labeled natural ligands (VLDL and β-VLDL), it was found that surface binding of 125I-VLDL or 125I-β-VLDL of ldl-A7 cells transfected with type I VLDLR recombinant (ldl-A7-VRI) was more higher than that of ldl-A7 cells transfected with type II VLDLR recombinant (ldl-A7-VRII). After being incubated with VLDL for different time, the contents of triglyceride and total cholesterol in cells were mensurated, and the formation of foam cells and accumulation of lipid in cells was observed by oil-red O staining. The results showed that the contents of triglyceride and total cholesterol in ldl-A7-VR I were much higher than those in ldl-A7-VR II, and ldl-A7-VR I could transform into foam cells notably. It was suggested that type I VLDLR binds with relative higher affinity to VLDL and β-VLDL, and internalizes much more lipoprotein into cells. As a result, we can conclude that type I VLDLR plays a more important role in lipoprotein metabolism and foam cells formation than type II VLDLR.     

不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响

目的探讨不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素（recombinant adeno-associated viruscarrying human angiostatin gene,rAAV-AS）对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）大鼠肾功能的影响。方法60只清洁级雄性SD大鼠随机抽取10只作为正常对照组（NC组）,其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射链尿佐菌素（STZ）60 mg/kg,72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功,适应性喂养1周后,把糖尿病大鼠随机分为DN组（n=10）,rAAV-0组（n=10）,AS1组（n=10,1×1012VG/kg）,AS2组（n=10,2×1012VG/kg）,AS3组（n=10,4×1012VG/kg）。AS1组、AS2组和AS3组3组大鼠尾静脉注射rAAV-AS,NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水,rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起,整个实验过程共持续8周。8周后检测各组大鼠的体重（body weight,BW）、肾重（kidney weight,KW）,计算肾指数（kidney in-dex,KI）,检测血糖（blood glucose,BG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）、尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、血肌酐（serum creatinine,SCr）、尿微量白蛋白（miscroalbunminuria,MAU）。结果与NC组相比,DN、rAAV-0、AS1组的KI、MAU、BUN、SCr、BG、HbA1c明显增高（P〈0.05）;与DN组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr明显降低（P〈0.05）;与rAAV-0组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr降低（P〈0.05）;与AS1组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr降低（P〈0.05）。结论中等剂量和大剂量rAAV-AS对DN大鼠肾脏具有保护作用,且不依赖血糖降低而起作用。     

胃癌相关基因GCRG 213正反义表达重组腺相关病毒载体的构建

目的 构建胃癌相关基因GCRG 213正、反义表达重组腺相关病毒载体,制备相应的重组腺相关病毒.方法 通过引入限制性内切酶识别位点从pGEM-T质粒上扩增出胃癌相关基因GCRG 213的DNA片段,按正、反向克隆入pCMV-MCS载体,测序正确后用NotI酶切,克隆入pAAV-MCS载体,单、双酶切鉴定后,同pAAV-Helper、pAAV-RC质粒用磷酸钙转染法共转染AAV-293细胞制备病毒.结果 成功构建包含胃癌相关基因GCRG 213 正、反义克隆的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为4×1010v.g./ml腺相关病毒.结论 载体的构建和病毒制备为进一步研究GCRG 213的体内功能打下了基础.     

腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的非致病特性使得以其为基础的重组病毒载体具有卓越的安全性,成为在基因治疗中最富吸引力的候选载体之一,并且在多种疾病的临床治疗中广泛应用。在过去的十余年中,随着分子病毒学领域对AAV基础研究的进展,研究者不断地为重组腺相关病毒的生产和改良提供新的思路和方案,以改善其对宿主或靶向细胞的感染选择性和转导效率,其中相当部分已逐渐向临床试验阶段过渡。本综述将在介绍AAV基本生物学特征的同时,结合一些实验室研究的成功案例,重点讨论AAV的改良策略、实施方案与应用特点,并对当前以AAV为载体的基因治疗的全球现状及其所面临的挑战与前景进行分析和探讨。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态与血浆高浓度低密度脂蛋白的风险

目的:研究潮汕人群3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因多态性与血浆高浓度低密度脂蛋白(LDL)的风险.方法:收集潮汕籍汉族高浓度LDL 792例,并与1 073名健康人对照,用SNPstream技术检测样本HMG-CoA还原酶基因多态性.结果:2个单核苷酸多态性位点(rs3846662和rs12916)与高浓度LDL均有相关性(P＜0.05),2个单倍型G-T-C和A-C-C在两组中的分布差异有统计学意义(P＜0.05).结论:HMG-CoA还原酶2个单核苷酸多态性和2个单倍型均与血浆高浓度低密度脂蛋白LDL存在相关性.     

NME1重组腺病毒构建及表达鉴定

目的：应用 AdEasyTM 腺病毒载体系统构建含人 NME1基因的重组腺病毒,检测 NME1基因在肺癌细胞的表达。方法从人肝脏标本克隆带有 KpnⅠ,XhoⅠ双酶切位点的 NME1cDNA,利用细菌体内同源重组法将 NME1正向连接至腺病毒载体上,测序鉴定正确后,于 QBI-293A 细胞中包装扩增,TCID 50法检测重组腺病毒滴度,重组腺病毒转染至肺癌细胞 GLC-82,检测 NME1在细胞内表达。结果肝脏组织克隆出470bp 条带,测序与 NME1编码序列相符,测得重组腺病毒滴度为10^10 TCID 50/ mL ,免疫实验显示 NME1在 GLC-82细胞成功表达。结论成功构建含人 NME1基因的重组腺病毒并转染肺癌细胞,检测到 NME1在肺癌细胞中正常表达。