一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析

目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,HMGR)基因的c DNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析。方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因c DNA全长。构建p EASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达。利用生物信息学方法分析克隆到的c DNA序列并预测结构和功能。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况。结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR c DNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR c DNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2。SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白。Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系最为相近。结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上。HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量最高的是叶。结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础。     

阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的 克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶--3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达.方法 用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异.结果 获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511).AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域.保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族.AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达.结论 从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础.     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础.方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析.结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右.结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础.     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性.方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析.结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型.结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性.     

金钗石斛中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因的克隆及特征分析

目的克隆金钗石斛Dendrobium nobile中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase,HMGS)基因DnHMGS,并进行生物信息学和表达分析。方法采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得DnHMGS基因cDNA全长;生物信息学分析编码蛋白的理化特性、结构域等特征;用DNASTAR、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建分析;借助实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果 DnHMGS基因全长为1 816 bp(GenBank注册号KX789180),编码一条由474个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为52 458.47,等电点5.98。DnHMGS蛋白具有植物HMGS酶的典型结构域和活性中心,与凤梨、稻、玉米等单子叶植物亲缘关系较近。DnHMGS基因具有组织表达特异性,接菌前,DnHMGS转录本在金钗石斛叶中的表达量最高,为根、茎中的2倍以上。但接菌后DnHMGS基因表达情况转变为茎叶根。结论首次从金钗石斛中克隆得到HMGS基因的全长cDNA,该基因的分子鉴定为进一步揭示该基因在金钗石斛萜类物质合成代谢途径中的作用及菌根真菌影响石斛碱生物合成的调控机制奠定了基础。     

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。     

茅苍术HMGR基因保守区片段的克隆与分析

目的对茅苍术3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增技术,以茅苍术嫩叶总RNA的cDNA为模板扩增茅苍术HMGR基因的保守区片断。结果序列分析表明,所克隆的cDNA保守区序列长度为458bp,而且同时得到了两个核苷酸序列的同源性为84.28%的片段,相应的氨基酸序列的同源性为92.11%。分别命名为HMGRcr1,HMGR-cr2。推断这可能是该基因家族中的两个成员。而且同源序列比对发现,推断的HMGRcr1氨基酸序列和HMGRcr2氨基酸序列与其他植物都有较高的同源性。结论首次分离并报道了茅苍术HMGRcDNA克隆,为进一步研究萜类生物合成机制及其在提高植物药用价值方面提供理论依据。     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

罗汉果3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是萜类甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway,MVA)中的第一个限速酶,是细胞质中萜类代谢途径中的重要调控位点。该研究以授粉后0,1,3,15,30 d的罗汉果为实验材料,基于转录组数据,从罗汉果cDNA中克隆得到2个HMGR基因,分别命名为SgHMGR2(GenBank登录号MT270447)和SgHMGR3(GenBank登录号MT270448)。基因包含开放阅读框(ORF)分别为1 746,1 782 bp,编码582,594个氨基酸,生物信息学分析推测其分子质量分别为62.7,63.2 kDa,等电点(theoretical pI)为8.34,7.47,均不含信号肽,为非分泌型蛋白,并且存在2个跨膜结构。结合蛋白质保守结构域以及进化树分析,证实该基因确为HMGR家族基因。利用实时荧光定量PCR检测SgHMGRs在授粉后不同时间的罗汉果中的表达模式,结果表明SgHMGRs均在授粉后15 d表达量最高。该研究首次从罗汉果中克隆得到2条全长SgHMGRs,并揭示了SgHMGRs在授粉后不同时间罗汉果中的差异表达,为罗汉果萜类化合物生物合成途径关键酶基因元件的挖掘提供研究基础。     

产地、生长期、商品规格等不同因素对罗汉果止咳作用的影响

目的考察不同因素对罗汉果止咳作用的影响。方法采用氨水引咳法,按序贯法(即上下法)求半数有效量的原理,计算小鼠半数引咳时间(EDT50),以给药组与对照组EDT50比值(R)评价不同产地、育苗方式、果实生长期、商品规格罗汉果以及干罗汉果与鲜罗汉果的止咳作用。结果湖南衡阳、广西南宁、广西永福县龙江及百寿采收的罗汉果均有止咳作用(R130%),尤其是广西永福县龙江和百寿的罗汉果止咳作用显著(R150%);扦插苗和组培苗生长得到的罗汉果均有止咳作用(R130%);果实生长期40~45 d和60~70 d的未成熟果无止咳作用(R130%);鲜果和干果都有止咳作用(R130%),但干果作用显著(R150%);一级果和响果有止咳作用(R130%),二级果没有止咳作用(R130%)。结论不同产地、繁育技术、是否烘干对罗汉果的止咳作用影响不大,但果实生长期和商品规格对罗汉果的止咳作用有影响。     

罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择

罗汉果为药食两用的传统中药,研究从罗汉果转录组中选取了Actin,18SrRNA,ubiquilin,ef1-α,ef1-β,Tubulin作为候选基因,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT,RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析,首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因,结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达最稳定,是样品基因分析适合的内参基因,对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用,也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考,确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性.     

狭叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因组织表达分析

目的筛选适宜狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium组织表达分析的内参基因,分析柴胡皂苷合成关键酶基因的组织表达模式。方法选取Actin、α-tubulin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,分别使用Delta CT、Best Keeper、Norm Finder、ge Norm软件对各候选内参基因的稳定性进行评价,并对候选内参基因的稳定性进行验证,利用实时荧光定量PCR技术,以筛选得到的内参基因分析狭叶柴胡根、茎、叶、果中柴胡皂苷合成关键酶基因HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS基因的组织表达模式。结果候选内参基因平均表达稳定性由高到低排序为β-tubulinCyclophilinActinEF-1αα-tubulin,β-tubulin是狭叶柴胡基因组织表达分析的适宜内参基因。HMGR基因表达量由高到低为根茎/果叶,IPPI基因表达量由高到低为根茎果叶,FPS基因表达量由高到低为叶根茎果,SS基因表达量由高到低为叶果根茎,β-AS基因表达量高低为叶根果茎,其中HMGR与IPPI及FPS与β-AS基因的表达显著呈正相关(P0.05)。结论筛选得到了狭叶柴胡不同组织基因表达分析的最适内参基因为β-tubulin,为狭叶柴胡基因组织表达分析奠定方法学基础。柴胡皂苷合成关键酶基因有不同的组织表达模式,可能参与调控狭叶柴胡不同组织中柴胡皂苷合成与积累的流向。     

栽培远志qRT-PCR内参基因筛选与P450s基因的时空表达分析

目的 筛选适用于不同生长年限和不同部位的栽培远志实时荧光定量PCR分析（quantitative real time PCR,qRT-PCR）的稳定内参基因,为远志体内各个基因表达分析提供合适内参基因。并对4个细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase,P450s）基因在上述远志样品中的差异表达进行分析,明确4个P450s基因在栽培远志中的时空表达分布。方法 通过qRT-PCR获取Tubulin 1、Tubulin 2、Elongation 1、Elongation 2、Actin 1、Actin 2、GAPDH和cdc-42 8个候选内参基因在上述远志样品中的熔解曲线与C_t值;利用软件geNorm和NormFinder对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过qRT-PCR分析4个P450s基因CYP709B2、CYP71AP39、CYP88A85、CYP714E38在上述远志样品中的相对表达情况。结果 geNorm分析结果表明,在远志（1~3年生）根、茎、叶、花中稳定表达的为Tubulin 2与Elongation 1;NormFinder结果显示,Elongation 1是最稳定的内参。CYP709B2、CYP71AP39基因在远志茎、叶（1~3年生）中的mRNA表达量最高,在根与花中的表达量则较少。而CYP88A85、CYP714E38基因则在远志根（1~3年生）中的mRNA表达水平较高。结论 Elongation 1适合作为栽培远志体内基因表达分析的内参基因。栽培远志中的P450s基因在远志根、茎、叶、花中的表达趋势不一致。     

陆英HMGS基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆陆英Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGS基因c DNA序列并对HMGS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测了HMGS基因在陆英的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGS基因c DNA全长为1 401 bp,编码466个氨基酸。生物信息学预测HMGS蛋白无跨膜区,不含信号肽。HMGS基因主要在陆英的花和根状茎中表达较高,在叶中表达相对较低。结论首次从陆英中克隆了HMGS基因,为进一步阐明该基因在陆英萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一,在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归4CL编码基因全长cDNA序列,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明,获得的4CL cDNA序列(在GenBank已注册,登录号为KT880508) 全长1 815 bp,含有1个1 632 bp 的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达,随着苗龄增大,茎、叶中的相对表达量显著增加(P<0.05),而根中表达量变化不大,表明4CL基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能,解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。     

巴戟天实时荧光定量PCR内参基因的选择

目的选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测。方法以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulinalpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因。利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因。选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析。结果内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性。在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根<茎<叶,DXR的相对表达量为茎<根<叶。在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高。结论筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性。