日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因的杆状病毒表达载体构建和在昆虫细胞中的表达

目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达。方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pFASTA-TCTP,使pFASTA-TCTP与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组BacmidGFP-TCTP克隆,提取BacmidGFP-TCTP转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过荧光镜观察、RT-PCR、SDS-PAGE和Western-Blotting检测表达情况。结果获得了重组SjTCTP的杆状病毒,细胞能表达出与SjTCTP单抗结合的、分子量为23kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白。结论SjTCTP能在昆虫细胞中获得良好表达,为其的分子生物学活性研究奠定了基础。     

利用杆状病毒系统表达重组HBV聚合酶RT区段

目的利用杆状病毒表达载体系统制备重组HBV聚合酶RT区段蛋白。方法构建含有HBVP基因RT区段的杆状病毒转移载体pFastBac HT-RT，转化大肠埃希菌DH10B-ac进行重组，提取重组BacmidDNA质粒，转染昆虫细胞SD获得含有HBVP基因RT区段的重组杆状病毒。重组的杆状病毒再感染SO细胞进行HBVP基因RT区段蛋白表达，通过Western blot检测表达情况。结果成功构建了含HBVP基因RT区段的重组杆状病毒，昆虫细胞Sf9中能检测到HBVP基因RT区段蛋白的表达。结论利用杆状病毒表达系统能成功地表达HBVP基因RT区段蛋白。     

利用昆虫杆状病毒表达系统表达人KCTD9蛋白

目的应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(sf9细胞)中表达人KCTD9蛋白,以进行其功能学研究。方法从pMD18-T-hKCTD9质粒中扩增hKCTD9全长基因片段,连接至pENTR/D-TOPO载体,将pENTR/D-TOPO-hKCTD9质粒与线形杆状病毒DNA在体外重组后,转染易感细胞系昆虫sf9细胞。采用免疫共聚焦和WesternBlot法分析融合蛋白的表达;在电子显微镜下观察病毒颗粒的形成。结果凝胶电泳分析hKCTD9基因存在于各载体中;激光免疫共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒的sf9细胞核内可见绿色荧光,提示目的基因表达正确;WesternBlot进一步显示hKCTD9蛋白大小约为55KD;透射电子显微镜观察发现被感染的sf9细胞核涨大、透亮,核内清晰可见大量的杆状病毒颗粒。结论 hKCTD9在昆虫杆状病毒表达系统中被成功表达,为进一步功能学研究奠定了基础。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的　利用杆状病毒 昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达 ,用SDS PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况 ;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白 ;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白 )为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性 ;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性。结果　HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达 ;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液 ;从 5× 10 7细胞中总共获得 0 .2mg重组蛋白 ,纯度大于 90 %;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段 ;血清学实验证实该蛋白抗原性很好。结论　昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白 ,具有良好的酶学活性以及抗原性。     

鼠IL-2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的构建携带鼠IL-2基因的重组杆状病毒表达载体。方法将目的基因鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒;收获完整重组杆状病毒,反复感染Sf9细胞扩增病毒,提取杆状病毒基因组,用PCR验证重组杆状病毒的正确性。结果成功构建鼠IL-2基因杆状病毒表达载体。结论本试验为进一步在哺乳细胞中表达鼠IL-2基因、开发研究IL-2奠定了基础,同时亦为其他蛋白质的真核细胞表达提供了方法参考。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

虎α干扰素与虎白蛋白融合蛋白的表达与鉴定

目的通过杆状病毒表达系统表达虎干扰素蛋白及其融合白蛋白后的长效干扰素蛋白。方法合成虎α干扰素基因IFN-α和融合虎白蛋白的长效干扰素基因IFN-α+ALB,经双酶切和酶连后转化大肠埃希菌DH5α获得重组质粒,鉴定正确后转化DH10Bac感受态,经蓝白斑筛选获得重组杆状病毒质粒,测序验证后转染昆虫细胞Sf9,并进行盲传。提取P3代细胞的上清基因组,检测目的基因表达情况并大量培养。收集细胞,超声破碎,取上清,经镍柱纯化后获得蛋白IFN-α和IFN-α+ALB,用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白的表达。并通过MDCK-H5N1系统进行重组蛋白的体外活性验证试验。结果构建的重组杆状病毒质粒测序验证正确,转染昆虫细胞Sf9后表达分子质量与预期相一致的两种蛋白,其体外活性试验显示长效干扰素抗病毒效果更好。结论成功构建了虎长效干扰素重组质粒,表达的IFN-α融合虎白蛋白具有长效干扰素作用,为进一步研究对比其与干扰素蛋白的功能奠定了基础。