软骨细胞与成纤维细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 软骨微环境对软骨形成具有重要作用.本实验探讨软骨细胞与成纤维细胞共培养体外构建软骨的可行性.方法 分别培养猪软骨细胞与人成纤维细胞,将两种细胞按3:7(软骨细胞:成纤维细胞)比例混匀,以5.0×107/ml终浓度接种于聚羟基乙酸支架(PGA,直径9mm,高2mm)作为共培养组,相同终浓度单纯软骨细胞和单纯成纤维细胞分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照.每组各接种3例标本,每例接种细胞悬液200μl.全部标本均体外培养12周后取材,通过大体观察、组织学及免疫组化等检测对构建软骨进行评价.结果 各组细胞均与材料支架粘附良好.体外培养12周后,阳性对照组(软骨细胞组)及共培养组均形成成熟的软骨样组织,组织学及免疫组化显示有成熟的软骨陷窝样结构及Ⅱ型胶原表达.软骨细胞组在体外培养过程中能基本保持复合物初始的大小和形状,形成的软骨在组织学上也教为均匀一致.共培养组在培养过程中稍有缩小,在复合物的周边区域形成了均质的软骨样组织,但在近中心区域存在一定量的纤维性组织.阴性对照组(单纯成纤维细胞组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,未形成软骨样组织.结论 软骨微环境在体外软骨分化及软骨形成中具有重要作用,软骨细胞与成纤维细胞体外共培养能形成软骨样组织.     

残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究

目的验证残耳软骨细胞与脂肪来源的间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养,体内构建软骨的可行性。方法分离培养同一先天性小耳畸形患者来源的残耳细胞及脂肪干细胞。24只裸鼠随机分为4组:①实验组,接种残耳软骨细胞及脂肪干细胞,两种细胞以1∶1比例混合,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;②对照组1,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;③对照组2,接种单纯ADSCs,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;④对照组3,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为2.5×107 cells/mL。每组接种6只裸鼠,每只接种0.2 mL。体内培养10周后取材。通过对新生组织的大体观察、测量湿重、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色等方法对各组新生软骨进行比较。结果实验组、对照组1与对照组3产生不同组织量的软骨样组织,对照组2形成纤维样组织;实验组平均湿重及糖胺多糖含量达到对照组1的88%以上,对照组3平均湿重低于对照组1的40%;HE染色示实验组、对照组1与对照组3的标本均有软骨陷窝形成,对照组2未见软骨陷窝形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色示实验组、对照组1与对照组3均可见Ⅱ型胶原表达;对照组2未见Ⅱ型胶原表达。结论体内共培养条件下,残耳软骨微环境可有效促进脂肪干细胞向软骨方向分化,残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨具备可行性。     

人真皮成纤维细胞体外构建组织工程化软骨的初步探索

目的 利用软骨细胞提供的体外软骨诱导微环境,探讨人真皮成纤维细胞在体外构建软骨的可行性.方法 分别培养猪的软骨细胞与人真皮成纤维细胞,将2种细胞按1:1(软骨细胞:成纤维细胞)比例混匀,以5.0×10~7/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸支架(PGA,直径9 mm,高2mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯成纤维细胞分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照.每组各接种3个标本,每个接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、组织学及免疫组化等相关检测对构建软骨进行评价.结果 软骨细胞组(阳性对照组)基本保持了复合物初始的大小和形状,组织周边和中央均有较均质的软骨陷窝样结构形成,表达软骨特异性细胞外基质;共培养组的组织稍有缩小,组织周边也有软骨陷窝样结构形成,表达软骨特异性细胞外基质,但组织内大部分区域形成了纤维样组织,特别是通过人核抗原免疫组化和对应的Safranin O染色结果,可以看到少量人核抗原阳性的细胞形成了较成熟的陷窝样结构,表达软骨特异性基质.单纯成纤维细胞组(阴性对照组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,未形成软骨样组织.结论 软骨细胞共培养体系可以有效地诱导人真皮成纤维细胞中一定比例的细胞向软骨分化,并能在体外构建软骨样组织.     

共培养诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的初步研究

目的 探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性.方法 GFP标记的小鼠ES细胞初步分化为EB后,将EB消化为单个细胞,同猪关节软骨细胞按一定比例(1∶3)昆合后接种于PGA材料,体外培养1周后植入裸鼠皮下3周取材.对照组为EB细胞接种组及软骨细胞接种组.取材后行连续冰冻切片,切片分别做荧光拍照,HE染色及甲苯胺蓝染色.结果 组织学结果显示,EB细胞接种组形成畸胎瘤;软骨细胞对照组形成软骨组织;实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体.甲苯胺蓝染色结果和荧光照片对照结果显示,部分软骨组织GFP阳性,由小鼠ES细胞分化而来.结论 软骨共培养体系可以诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化,但得到的软骨组织不纯,混有畸胎瘤组织.     

第三代超声辅助吸脂获取的h ADSCs构建组织工程软骨的实验研究

目的观察应用第三代超声辅助吸脂技术获取的人脂肪干细胞(hADSCs)与残耳软骨细胞共培养在体内构建组织工程软骨的效果。方法分离培养先天性小耳畸形患者来源的残耳软骨细胞,通过第三代超声辅助吸脂和常规负压吸脂术获取脂肪,并提取hADSCs。实验分为3组:对照组1,PGA/PLA支架接种残耳软骨细胞;对照组2,PGA/PLA支架接种残耳软骨细胞+常规负压抽脂获取的hADSCs;实验组,PGA/PLA支架接种残耳软骨细胞+第三代超声辅助抽脂获取的hADSCs。所有细胞-支架复合物经体外培养4周后植入裸鼠体内,8周后取材。对体外培养4周和体内培养8周的各组标本分别进行大体观察、湿重测量、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色和生物力学检测。结果应用第三代超声辅助吸脂和常规负压吸脂都可获得hADSCs。细胞-支架复合物体外培养4周,对照组1、2与实验组都形成软骨样组织,组织学观察显示软骨特异性ECM沉积,但结构疏松,仍有未降解的PGA支架材料。体内培养8周后取材,对照组1组织学观察显示软骨组织不均一,大部分区域形成成熟软骨组织,但有部分区域组织结构疏松,软骨特异性ECM分泌较少;对照组2和实验组则形成成熟的软骨组织,结构均一,可见大量的软骨陷窝和细胞外基质分泌,支架材料完全降解。湿重、糖胺多糖、生物力学检测结果都显示对照组2和实验组显著优于对照组1,对照组2与实验组无显著差异。结论应用第三代超声辅助吸脂可安全有效地获取hADSCs,与残耳软骨细胞共培养可形成成熟的组织工程软骨。     

异体软骨细胞诱导骨髓基质细胞成软骨分化的量效关系

目的 探讨利用异体软骨细胞作为诱导因素,与骨髓基质细胞(BMSCs)共培养体外构建软骨复合物的可行性,以及两种细胞混合比例与构建软骨质量的量效关系.方法 体外分别培养扩增BMSCs与异体软骨细胞,软骨细胞与BMSCs的混合比例分别为1:9(A组)、2:8(B组)、3:7(C组)、100%软骨细胞(D组)、100%BMSCs(E组),以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸 (PGA)材料支架上培养,各组标本均于体外培养6周后取材,通过大体观察、糖胺聚糖(GAG)含量测定、组织学以及免疫组织化学等方法检测组织工程化软骨形成的情况.结果 各组细胞均与材料黏附良好,C、D两组标本基本保持原有的大小和形状,外观洁白、光滑类似软骨组织;组织学显示两组均有连续的软骨陷窝样结构形成,免疫组织化学显示有大量Ⅱ型胶原沉积.定量结果显示,C组的GAG含量达到D组的70%以上.其他各组培养物体积明显缩小,组织学及免疫组织化学显示软骨样组织形成不佳.结论 异体软骨细胞与BMSC共培养可以构建出较好的软骨组织,表明软骨细胞对BMSCs发挥诱导作用,但是软骨细胞必须达到一定的数量要求.     

软骨细胞诱导骨髓基质细胞体内软骨形成

目的探讨软骨细胞在体内非软骨形成部位促进骨髓基质细胞(BMSCs)向软骨分化并形成软骨的可行性。方法猪BMSCs与软骨细胞按一定比例(6∶4或7∶3)混匀,取2.5×107个混合细胞悬浮于0.5ml30%Pluronic溶液后注射到裸鼠皮下(n=6)。相同数量的单纯软骨细胞或BMSCs同样方法注射,分别作为阳性对照及阴性对照,0.75×107个软骨细胞同样注射作为低浓度软骨细胞对照。各组均8周后取材检测。结果混合细胞组及阳性对照组均形成了成熟的软骨。组织学可见成熟软骨陷窝、异染基质及Ⅱ型胶原表达。两组新生软骨糖胺多糖(GAG)含量差异无统计学意义(P>0.05),两混合组平均湿重分别为(320±48)mg和(294±37)mg,均达到阳性对照组70%以上。BMSCs组仅形成了纤维性组织,低浓度软骨细胞组在局部形成了少量软骨,但新生软骨平均湿重低于阳性对照的30%。结论上述结果提示软骨细胞能诱导BMSCs在体内非软骨形成部位向软骨分化并形成软骨组织。     

软骨细胞诱导骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的 探讨以聚羟基乙酸(PGA)包裹特定形态的医用假体材料--多孔高密度聚乙烯(HDPE,商品名为MEDPOR)为支架,应用软骨细胞诱导骨髓基质干细胞(BMSCs),共培养构建特定形态的带内支撑组织工程化软骨医用假体的可能性.方法 以直径3 mm、长5 mm的圆柱形HDPE,外裹 1 mm厚PGA为支架,将体外分别培养的新生猪BMSCs和耳郭软骨细胞按7∶3混合,以10×10 7/ml细胞浓度接种于支架上,同时以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别接种,作为阳性对照组(PC组)和阴性对照组(NC组).经体外培养2周及在裸鼠皮下移植4、8周后取材 ,行大体观察、组织学、组织化学及免疫组化检测.结果 各组细胞均与材料黏附良好.实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的HDPE-软骨复合体,内支撑的HDPE与外层软骨结合紧密.组织学可见成熟的软骨陷窝结构,软骨渗入HDPE孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原呈强阳性表达.结论 以HDPE为内支撑,外裹PGA的支架,接种混合细胞,可于皮下构建特定形态、组织学良好的HDPE-软骨复合体.     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨组织的实验研究

目的 探讨利用软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质细胞(BMSC)在体外构建软骨组织的可行性.方法 将分离出的猪骨髓基质细胞和软骨细胞进行体外培养,收集软骨细胞培养上清液,作为骨髓基质细胞诱导液从第2代开始进行诱导分化.7 d后取出标本,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达.体外分离培养的骨髓基质细胞与软骨细胞,扩增后两者以8∶2比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC以及20%上述浓度(1.0×107/ml)的单纯软骨细胞作为对照组.标本于8周后取材,行大体观察、湿重、蛋白多糖(GAGs)含量测定、组织学及免疫组化等相关检测.结果 经诱导后的骨髓基质细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.混合细胞组及阳性对照组体外培养8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,两组新生软骨在外观及组织学特征上也基本相同,免疫组化结果 表明两组均大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,共培养组的平均湿重和蛋白多糖(GAGs)含量均达到阳性对照组的70%以上.而单纯骨髓基质细胞组仅在局部形成了极少量幼稚的软骨样组织,且材料支架明显皱缩变形.低软骨细胞浓度组虽新生软骨湿重量能达阳性对照组的30%,但材料支架明显皱缩变形,仅在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论 软骨细胞能在一定程度上提供软骨形成的微环境,有效地诱导BMSC向软骨细胞分化,并在体外形成组织工程化的软骨组织.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of chondrogenesis in vitro with bone marrow stromal cells (BMSCs) induced by the co-cultured chondrocytes. Methods The BMSCs and chondrocytes were separated from pig and cultured. The supernatant of chondrocytes was used as the inducing solution for BMSCs from the 2nd generation. 7 days later, samples were taken and underwent immunohistochemistry and RT-PCR for detection of the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen,type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA. The cultured BMSCs and chondrocytes were mixed at a ratio of 8:2(BMSC: cartilage cell) and were inoculated into a polyglycolic acid/polylactic acid (PGA/PLA) scaffold at the final concentration of 5.0 × 107/ml. The cartilage cells and BMSCs were also inoculated seperately at the same concentration as the positive and negative control. Pure cartilage cells at 20% of the abovementioned concentration (1.0 × 107/ml) were used as the low concentration cartilage cell control group. Samples were collected 8 weeks later. General observations, wet weight, glycosaminoglycans (GAGs) determination and histological and immunohistochemistry examinations were performed. Results The expression of type Ⅱ collagen, type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA were positive in induced BMSCs.In the co-cultured group and the positive control group, pure mature cartilage was formed after 8 weeks of culture in vitro, and the size and shape of the scaffold were maintained. The newly formed cartilage in the two groups were almost the same in appearance and histological properties. The immunohistochemistry results indicated that the cartilage cells of the two groups all expressed ample cartilage-specific type Ⅱ collagen. The average wet weight and GAG content in the co-cultured group reached more than 70% of those in positive control group. Only an extremely small amount of immature cartilage tissues was formed in local regions in pure BMSC group, and the scaffold was obviously shrunk and deformed. Although the wet weight of newly generated cartilage tissue in the low concentration cartilage cell group reached 30% of that in positive control group, the scaffold was obviously shrunken and deformed. Only regional and discontinuous cartilage tissues were formed, and the amount of newly formed cartilage was obviously less than that in the co-culture group and the positive control group. Conclusions Chondrocytes can provide a micro-environment for the formation of cartilage, and also effectively induce BMSC to differentiate into chondrocytes and form tissue-engineered cartilage in vitro.     

软骨细胞诱导骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的探讨以聚羟基乙酸(PGA)包裹特定形态的医用假体材料多孔高密度聚乙烯(HDPE,商品名为MEDPOR)为支架,应用软骨细胞诱导骨髓基质干细胞(BMSCs),共培养构建特定形态的带内支撑组织工程化软骨医用假体的可能性。方法以直径3mm、长5mm的圆柱形HDPE,外裹1mm厚PGA为支架,将体外分别培养的新生猪BMSCs和耳郭软骨细胞按7:3混合,以10×107/ml细胞浓度接种于支架上,同时以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别接种,作为阳性对照组(PC组)和阴性对照组(NC组)。经体外培养2周及在裸鼠皮下移植4、8周后取材,行大体观察、组织学、组织化学及免疫组化检测。结果各组细胞均与材料黏附良好。实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的HDPE-软骨复合体,内支撑的HDPE与外层软骨结合紧密。组织学可见成熟的软骨陷窝结构,软骨渗入HDPE孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原呈强阳性表达。结论以HDPE为内支撑,外裹PGA的支架,接种混合细胞,可于皮下构建特定形态、组织学良好的HDPE-软骨复合体。     

共培养系统下软骨细胞对骨髓间质干细胞向软骨细胞分化的诱导作用

 目的观察共培养系统下正常软骨细胞和关节炎软骨细胞对骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向软骨细胞分化的促进作用。方法分离新西兰兔 BMSCs及正常软骨细胞。制作兔膝关节炎模型,提取兔关节炎软骨细胞。将 BMSCs与低熔点琼脂糖复合成凝胶块,构建软骨细胞-BMCSs共培养系统,分为正常软骨细胞 P0-BMSCs组、正常软骨细胞 P3-BMSCs组、关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组、关节炎软骨细胞 P3-BMSCs组及 BMSCs组(对照组)。在 3、7、14天取材行实时定量 PCR、糖胺聚糖含量、细胞活性检测及组织切片观察。结果(1)正常软骨细胞 P0-BMSCs组的 II 型胶原基因表达增强,在 3、7、14天分别为对照组的 5.1、7.2、11.2倍; 正常软骨细胞 P3-BMSCs组 I 、 II 型胶原及蛋白聚糖基因表达均未见增强; 关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组蛋白聚糖基因表达增强,在 14天为对照组的 7.8倍; 关节炎软骨细胞 P3-BMSCs组 I 型胶原基因表达水平在三个时间点均低于对照组。(2)正常软骨细胞 P0-BMSCs组糖胺聚糖含量为对照组的 2.59倍。除关节炎软骨细胞 P0-BMSCs组外,其余三组与对照组比较差异均有统计学意义。阿新蓝染色各组均为阳性,正常软骨细胞 P0-BMSCs组的细胞及细胞外基质蓝染最深。结论兔正常 P0软骨细胞与兔关节炎 P0软骨细胞能够有效促进 BMSCs向软骨细胞分化,正常 P3软骨细胞的促分化作用微弱,而关节炎 P3软骨细胞不具有促分化作用。     

力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化

目的：研究不同的应力刺激对软骨细胞与骨髓基质干细胞（BMSCs）共培养体外构建组织工程化软骨的影响。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞,二者按7：3比例混和,以5．0×107／ml的细胞密度接种于聚羟基乙酸（PGA）支架上,一周后根据不同的施加力分为4组：离心组、摇床组、搅拌组,静止培养作为对照组。6周后取材行相关检测。结果：三受力组形成的细胞材料复合物基本保持原来的体积与外形。HE染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,细胞外基质沉积均匀;Safranin-O及甲苯胺兰染色显示有大量的GAG形成,免疫组化检测II型胶原表达强阳性。三受力组标本组织湿重、体积、GAG含量等指标均优于对照组。结论：力学刺激有利于促进少量软骨细胞与BMSCs共培养体外软骨分化;并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

组织工程化软骨分泌的可溶性因子对骨髓基质干细胞诱导作用的实验研究

目的 探讨组织工程化软骨分泌的可溶性因子是否能够单独诱导骨髓基质干细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs)软骨分化.方法 体外培养扩增猪BMSCs、猪关节软骨细胞以及皮肤成纤维细胞,以5.0×107/ml的细胞终浓度分别接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,应用隔离池进行隔离共培养.以软骨细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为实验组,以皮肤成纤维细胞-材料复合物与BMSCs-材料复合物隔离共培养为对照组1,以单纯BMSCs-材料复合物为对照组2.各组标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察,组织学,以及免疫组织化学,RT-PCR等方法对新生组织进行评价.结果 隔离共培养8周后,实验组软骨细胞材料-复合物诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织略有缩小,外观类似软骨组织,组织学检测见软骨陷窝样结构,SafraninO染色可见软骨特异性基质分泌,免疫组化显示有大量Ⅱ型胶原沉积,RT-PCR检测组织表达Ⅱ型胶原、Ⅸ型胶原、COMP、Sox9等软骨特异性基因,提示形成了较成熟软骨样组织;而对照组成纤维细胞材料复合物诱导的BMSCs-材料复合物和未经任何诱导的BMSCs-材料复合物形成的组织淡黄色,明显缩小、变薄、质地较软,组织学检测均未形成软骨陷窝样结构,主要为纤维性成分,各种软骨特异性相关检测均为阴性.结论 软骨细胞分泌的可溶性因子能够单独诱导BMSCs软骨分化,可能是软骨细胞形成的微环境中发挥诱导作用的主要因素.     

Variations in matrix composition and GAG fine structure among scaffolds for cartilage tissue engineering

OBJECTIVE: To compare matrix composition and glycosaminoglycan (GAG) fine structure among five scaffolds commonly used for in vitro chondrocyte culture and cartilage tissue engineering. DESIGN: Bovine articular chondrocytes were seeded into agarose, alginate, collagen I, fibrin and polyglycolic acid (PGA) constructs and cultured for 20 or 40 days. In addition to construct DNA and sulfated GAG (sGAG) contents, the delta-disaccharide compositions of the chondroitin/dermatan sulfate GAGs were determined for each scaffold group via fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE). RESULTS: Significant differences were found in cell proliferation and extracellular matrix accumulation among the five scaffold groups. Significant cell proliferation was observed for all scaffold types but occurred later (20-40 days) in PGA constructs compared to the other groups (0-20 days). By 40 days, agarose constructs had the highest sGAG to DNA ratio, while alginate and collagen I had the lowest levels. Quantitative differences in the Delta-disaccharide composition of the GAGs accumulated in the different scaffolds were also found, with the most striking variations in unsulfated and disulfated delta-disaccharides. Agarose constructs had the highest fraction of disulfated residues and the lowest fraction of unsulfated residues, with a 6-sulfated/4-sulfated disaccharide ratio most similar to that of native articular cartilage. CONCLUSIONS: The similarities and differences among scaffolds in proteoglycan accumulation and GAG composition suggest that the scaffold material directly or indirectly influences chondrocyte proteoglycan metabolism and may have an influence on the quality of tissue engineered cartilage.     

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.