RNA干涉抑制宫颈癌 CaSki细胞株 HPV16 E6基因的研究

背景与目的：研究表明宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)E6、E7癌基因密切相关,于是人们采用核酶或HPV E6、E7反义寡核苷酸抑制其表达来治疗宫颈癌,虽然取得了一定的效果,但仍面临基因抑制效率低、维持时间短、工作量大、耗费多等问题。本研究采用最新的RNA干扰技术干扰宫颈癌CaSki细胞中HPV16 E6转录,以了解其能否特异性抑制HPV16 E6基因及其时效性如何。方法：设计合成针对HPV16 E6的荧光标记siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过荧光照片计数荧光细胞占所有细胞的比例计算转染效率;测定转染后不同时间点的细胞凋亡率;RT-PCR测定HPV16 E6 mRNA变化,Western blot和流式细胞仪检测转染前后蛋白表达情况。结果：相差显微镜荧光照片显示细胞转染的效率为81％。HPV16 E6 siRNA转染细胞后24h、48h、5天凋亡率分别为7．7％、11．8％和37．4％,转染9天时凋亡率下降至12．6％。RT-PCR扩增结果显示,细胞转染前HPV16 E6 mRNA的量与siRNA阴性对照比较没有显著性差异,但转染后24h、48h、5天和9天分别减少了77％、83％、59％和41％;而作为内对照的β-actin mRNA在转染前后无变化。流式细胞仪定量测定HPV16 E6蛋白,结果显示转染后24h、48h和5天,蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％和71．3％;9天时抑制率有下降,但仍可达57．4％。此结果与HPV16 E6 Western blot结果相吻合。以Lamin A/C作为内对照,不同的时间点Lamin A/C蛋白表达均无差异。结论：宫颈癌CaSki细胞中确实有RNA干扰现象存在,对外源性的HPV16病毒E6基因的干扰具有基因特异性和高效性。     

HPV16 E6 E7 siRNA作用于人宫颈癌细胞株的实验研究

目的: 使用HPV16 E6、E7 siRNA处理表达HPV16阳性的人宫颈鳞癌细胞株CaSki和SiHa,观察其对HPV16 E6、E7原癌基因的特异性抑制作用,为探讨使用siRNA治疗宫颈癌的可行性提供实验基础. 方法: 分别设计并合成靶向于HPV16 E6、E7的siRNA各3条,经脂质体包裹后转染两株细胞,分别采用RT-PCR和Western Blot方法,通过对转染前后各时间段两基因mRNA及蛋白的表达情况的检测,验证RNAi作用的特异性及时效性. 结果: 同对照组相比,各E6、E7 siRNA均可引起靶基因表达水平的显著性下降(P<0.05);而空脂质体组及阴性对照siRNA组的靶基因表达水平则无明显变化.其中E6-1 siRNA和E7-2 siRNA对靶基因抑制作用较强.E6-1 siRNA和E7-2 siRNA转染两株细胞后24h、48h、72h及96h均可观察到靶基因表达的显著性降低(P<0.05),而对相应的非靶基因无明显抑制作用. 结论: 不同序列的E6、E7 siRNA,对靶基因的干扰效率不同;E6、E7 siRNA分别作用于宫颈鳞癌细胞株,均引起了靶基因的特异、高效性的抑制,而时非靶基因的表达无明显变化,且抑制作用至少维持到转染后96h.为进一步研究采用RAN干扰技术进行宫颈癌的生物治疗奠定了基础.     

HPV16 E6小干扰RNA对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的探讨HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)对人宫颈癌移植瘤的抑制作用。方法建立人宫颈癌CaSki细胞裸鼠皮下接种模型,将HPV16 E6 siRNA注入瘤体内(实验组),同时设对照组,动态观察并测定肿瘤的生长。采用原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡情况;免疫组化法测定E6、p53蛋白的表达;检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)含量;光镜观察肝肾脏结构的改变。结果HPV16 E6 siRNA处理后,肿瘤生长明显受到抑制,实验组肿瘤体积[(0.21±0.06)cm3]及瘤重[(0.13±0.04)g]均明显降低,与对照组差异有统计学意义(P<0.05);实验组肿瘤细胞凋亡[(29.8±1.4)%]明显增加,E6和p53蛋白表达均下调;实验组和对照组血清ALT、AST含量无明显差异,实验组肝肾脏结构无明显异常。结论HPV16 E6 siRNA能够抑制宫颈癌移植瘤生长,且对肝脏无毒副作用,可为官颈癌的治疗提供一个新的特异性基因治疗方法。     

HPV16感染及其E7蛋白表达与宫颈癌关系的研究

目的：探讨人砂状瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）及其Ｅ７蛋白表达与宫颈癌的关系。方法：运用ＰＣＲ技术探查６７例宫颈中ＨＰＶ１６感染率,并运用免疫组化ＡＢＣ法检测ＨＰＶ１６感染吕颈癌中Ｅ７蛋白表达情况。结果：ＨＰＶ１６在宫颈癌中的检出率为５０．７５％（３４／６７）,ＨＰＶ１６感染与宫颈癌临床分期和病理组织分级无关（Ｐ〉０．０５）,在ＨＰＶ１６感染的宫颈癌中,其Ｅ７蛋白阳民生表达率为８５．３０％（２９／３４     

短发夹状RNA抑制子宫颈癌CaSki细胞HPV 16 E7基因的研究

目的：研究短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）构建的人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16E7siRNA表达载体转染宫颈癌细胞株CaSki细胞后，在体内外对CaSki细胞E7基因的抑制作用。方法：利用脂质体将构建有HPV16E7特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的表达载体P1、P2、P3转染CaSki细胞，以实时荧光定量RT—PCR及流式细胞仪检测不同时间点E7mRNA和蛋白的变化，并将载体P1转染后的细胞接种到裸鼠皮下，4周后观察裸鼠体内皮下移植瘤体积和质量的差异，并用免疫组化检测瘤体组织中E7蛋白的表达变化。结果：表达载体P1、P2、P3均能抑制Caski细胞E7mRNA和蛋白的表达。其中载体P1抑制作用最强，在抗性克隆形成后1周，对E7mRNA和蛋白的抑制率分别为92．86％、84．21％；在抗性克隆形成后4周，抑制率仍分别为68．95％、62．50％。在接种后4周载体P1组裸鼠体内皮下移植瘤的体积和重量明显小于空载体组和对照组，同时E7蛋白的表达也被有效抑制，抑制率为74．75％。结论：构建有shRNA的E7siRNA表达载体在体内外可明显抑制E7基因的表达。     

宫颈癌及宫颈癌前病变组织HPV16/18E6E7基因突变分析

人乳头瘤病毒１６／１８型（humanpapillomavirustype１６／１８，HPV１６／１８）感染与宫颈癌发病密切相关，病毒的癌基因为病毒早期基因E６／E７。研究表明E６／E７基因的存在和表达对保持转化细胞以及癌细胞的表现型起决定性作用犤１～５犦。分子病毒学研究表明宫颈癌组织中肿瘤病毒基因存在变异，此种变异具有地域和种系发生的特点犤６犦。宫颈癌病毒病因研究的最终目的是为宫颈癌寻求一条早期预防的措施，为阻断疾病提供科学依据。１材料与方法１．１研究对象宫颈癌和宫颈癌前病变组织取自珠海市妇幼保健院、江西省妇幼保健院和大…     

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞中HPV16 E7基因的表达

目的:用真核表达siRNA干扰技术特异性抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E7癌基因的表达.方法:运用DNA重组技术构建表达特异性siRNA的 pGenesil-1/E7(PS7)重组质粒,用脂质体分别将重组质粒转染宫颈癌细胞系CaSKi细胞内,通过半定量RT-PCR 实验检测CaSKi/PS7细胞中E7 mRNA水平的变化;再用western blotting检测 CaSKi/PS7细胞中E7蛋白、磷酸化pRb 和去磷酸化Rb的表达;用免疫细胞化学法检测细胞中ki-67、NF-κB 、bcl-2和p16的表达.结果:成功构建了真核细胞表达的、特异性siRNA的PSN 和PS7重组质粒.在RNA干扰24、48和72小时后 CaSKi/PS7细胞中E7 mRNA分别下降了21.05%、 51.80%和49.10%;RNA干扰后的CaSKi/PS7细胞中E7蛋白的表达逐渐减低,而且磷酸化pRb表达降低和去磷酸化Rb 的表达升高;与CaSKi/PSN细胞相比,CaSKi/PS7细胞中的ki-67、NF-κB 和bcl-2表达降低,而p16的表达增加.结论:本研究成功构建了真核细胞体内表达特异性siRNA重组体,有效地抑制了宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E7基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制提供了新的资料和方法.     

小干扰RNA抑制宫颈癌Hela细胞株HPV18 E6、E7基因的表达

目的:以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)18型E6基因为靶点,研究小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对宫颈癌Hela细胞株HPV18基因组中恶性转化基因E6、E7的抑制作用及对细胞内P53蛋白表达的影响。方法:实验分细胞培养液阴性对照组(阴性对照组),无关序列siRNA对照组(无关序列对照组)及转染HPV18 E6-siRNA实验组(siRNA实验组)。设计并合成HPV18 E6-siRNA及无关序列siRNA,转染Hela细胞后,RT-PCR检测转染后48、120 h细胞内HPV18E6、E7mRNA的变化,Western blotting检测转染后48 h细胞内HPV18 E7和P53蛋白的变化。结果:siRNA转染Hela细胞的效率约为85%。siRNA转染后48 h,实验组细胞内HPV18E6、E7mRNA及E7蛋白含量降低,其含量分别为阴性对照组的33.33%、36.78%及33.84%;实验组细胞内P53蛋白含量增加,其含量为阴性对照组的2.194倍。siRNA转染后120 h,实验组细胞HPV18E6、E7mRNA含量恢复为阴性对照组的90.91%、101.60%。结论:HPV18 E6-siRNA体外能明显抑制宫颈癌Hela细胞HPV18E6、E7基因的表达,增加细胞内肿瘤抑制因子P53蛋白的水平。     

DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:通过观察DEK基因沉默后对CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡影响,探讨DEK原癌基因siRNA对宫颈癌细胞的影响和机制.方法:将DEK siRNA真核表达载体转入CaSki细胞,转染48 h后,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变情况.结果:与对照组和未转染组相比,转染psiRNA-hH...     

宫颈癌及其癌前病变组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白的表达及其意义

目的 探讨宫颈癌及其癌前病变组织中HPV16E6、E7蛋白的表达及其意义。方法 采用免疫组化SP法对15例正常宫颈、25例宫颈上皮内瘤变（C1N）以及61例浸润性宫颈癌组织进行了HPVl6E6、HPVl6E7蛋白表达的检测。结果在正常宫颈、CINI～Ⅱ、CINⅢ及浸润性宫颈癌中，HPVl6E6蛋白的阳性表达率分别为0（0／15）、7．14％（1／14）、36．36％（4／11）、59．02％（36／61）；CINⅢ和浸润性宫颈癌中HPVl6E6蛋白阳性表达率明显高于正常宫颈组织和CINI～Ⅱ（P〈0．05）；在高、中、低分化宫颈癌中，HPVl6E6蛋白阳性表达率分别为45．45％（5／11）、77．78％（14／18）、53．13％（17／32）；HPVl6E6蛋白在不同分化程度的宫颈癌组织中的阳性表达率有显著性差异（P〈0．05），但HPVl6E6蛋白表达与官颈癌组织分化程度无明显相关性（ys=0．123），HPVl6E6蛋白阳性表达率与宫颈癌临床分期和淋巴结转移无关（P〉0．05）。HPVl6E7蛋白在正常宫颈上皮、CINI-Ⅱ、CIN Ⅲ及浸润性富颈癌组织中的阳性表达率分别为20．00％（3／15）、42．86％（6／14）、63．64％（7／11）、57．38％（35／61），HPVl6E7蛋白在不同宫颈组织中的阳性表达率无明显差异（P=0．05）；HPVl6E7蛋白的表达与富颈癌临床分期、淋巴结转移和组织分化均无关（P〉0．05）。结论 HPVl6E6蛋白的检测有可能作为宫颈癌前病变转归的指标。     

HPV16 E7和Brn-3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义

 目的研究HPV16E7和Brn3a在各级宫颈癌前病变(CIN)中的表达情况以及两者之间的关系,从分子生物学水平探讨其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性,以期寻找新的宫颈癌前病变筛查方法。方法对71例患者行宫颈薄层细胞学检查(ThinprepCellTest,TCT),并在阴道镜下组织学活检,其TCT残留标本,用RTPCR法检测各标本中HPV16E7和Brn3a的表达。结果HPV16E7和Brn3a表达按细胞学分级和病理学分级其阳性率呈逐级增高趋势,差异均有显著性(P<0.0001)。两者作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的诊断标志物,其结果是一致的(P<0.05)。结论TCT残留标本适合进行RTPCR分析研究。HPV16E7可作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的生物标志物。Brn3a可作为可靠的CIN3生物标志物和HPV致癌基因转录活化的标志物。HPV16E7和Brn3a相互作用,可能为宫颈高度癌变发展的原因之一。     

HPV16-E6/E7 Oncogene Mutation and p53 Expression among Indonesian Women with Cervical Cancer

Objective: To characterize HPV16 E6/E7 mutation and its association with p53 expression among Indonesian women with cervical cancer. Methods: This is a cross-sectional study involving 31 Indonesian women with pathologically proven cervical cancer and HPV16 infection. Data about the clinical characteristics of the study population were obtained from the medical records. Biopsy specimen of the cervical cancer mass from each study participant was obtained for DNA isolation. The ORFs of E6 and E7 genes were amplified using specific primer designed according to K02718/HPV16R gene sequence obtained from GenBank. Sequencing was performed using software program MEGA10. HPV16 E6 and E7 prototype sequences for nucleotide alignment (HPv16. P, GenBank Access code: NC_001526) was selected from European variant. The sequence of nucleotide and amino acid was aligned using software program BioEdit. p53 expression was evaluated through immunohistochemistry and quantified using immunoreactivity score (IRS). Results: Twelve subjects (38.7%) present with E6 and E7 mutation. Median age, parity, stage and histologic type of the tumour did not associate with E6/E7 mutation. E6 and E7 mutation rate was 25.8% (8/31) and 12.9% (4/31), respectively. Seven single nucleotide changes were identified within the E6 and E7 oncogenes, including four non-synonymous and three synonymous mutations. E6 T27C was the most prevalent mutation (16.1%). Nonsynonymous mutations were more prevalent within E7 gene (9.6%) (N29T, N29S, and R77C). Median IRS did not differ between HPV16-E6/E7 variants and wildtype (p value = 0.990). There was no association between E6/E7 mutations and p53 expression in Indonesian women with cervical cancer (PR 1.4, 95% CI: 0.29-6.77, p value = 0.704). Conclusions: HPV16 E6 mutation was more prevalent than E7 mutation among Indonesian women. There was no association between E6/E7 mutation and p53 expression level.     

HPV16型E6、E7变异与宫颈癌发生发展的研究进展

宫颈癌是全球15 ～44岁女性中第二常见的恶性肿瘤,每年的死亡人数约为265 653人,在中国,宫颈癌的发生率及死亡率仍较高.高危型人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌前病变及宫颈癌发生的必要条件,HPV16是最常见的高危人乳头瘤病毒.HPV16编码的E6和E7蛋白在HPV相关的肿瘤中起关键作用.近年来的研究揭示了HPV16 E6、E7基因的变异引起氨基酸变化可影响E6、E7蛋白与p53、pRb 的结合,进而与宿主细胞恶性转化相关.本文将对近年来HPV16 E6、E7变异在宫颈癌发生发展中的作用作一综述.     

p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6在ASCUS中的表达及临床意义

目的：探讨p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6在宫颈细胞学诊断为非典型性鳞状细胞不明确意义型（ASCUS）中的表达及筛查潜在宫颈病变的价值。方法：对150例ASCUS患者行阴道镜检查并取活检,同时对该150例患者的TCT标本进行免疫细胞化学染色检测p16^INK4A的表达和RT-PCR法检测其中HPV16型口蛋白和18型E6蛋白（HPV16 E7／HPV18 E6）mRNA的表达。结果：p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA在ASCUS中表达的阳性率分别为37．33％和46．67％,随着病理级别的增加,p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA表达的阳性率也随之增加;p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA筛查ASCUS中宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为0．88、0．95、0．91、0．93和0．81、0．75、0．67、0．86,在p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA阳性的样本中,宫颈病变发生率分别为91．07％和67．14％,均明显高于阴性样本中的发病率7．45％和13．75％（P〈0．001）;ASCUS中宫颈病变样本中p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA呈高表达,且具有较高的一致性（K=0．6475）。结论：p16^INK4A和HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA在ASCUS中病理诊断为宫颈病变的样本中均呈高表达,对筛查潜在的宫颈病变具有重要意义,其中p16^INK4A的筛查效能优于HPV16 E7／HPV18 E6 mRNA;p16^INK4A能间接反映HPV的转录活性,在ASCUS的分流中有重要意义,且可视性的p16^INK4A免疫染色比HPV检测更直观。     

p16~(INK4A)和HPV16 E7/HPV18 E6在ASCUS中的表达及临床意义

目的:探讨p16 INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6在宫颈细胞学诊断为非典型性鳞状细胞不明确意义型(ASCUS)中的表达及筛查潜在宫颈病变的价值。方法:对150例ASCUS患者行阴道镜检查并取活检,同时对该150例患者的TCT标本进行免疫细胞化学染色检测p16INK4A的表达和RT-PCR法检测其中HPV16型E7蛋白和18型E6蛋白(HPV16 E7/HPV18 E6)mRNA的表达。结果:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中表达的阳性率分别为37.33%和46.67%,随着病理级别的增加,p16INK4A和HPV16E7/HPV18 E6 mRNA表达的阳性率也随之增加;p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA筛查ASCUS中宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为0.88、0.95、0.91、0.93和0.81、0.75、0.67、0.86,在p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA阳性的样本中,宫颈病变发生率分别为91.07%和67.14%,均明显高于阴性样本中的发病率7.45%和13.75%(P<0.001);ASCUS中宫颈病变样本中p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA呈高表达,且具有较高的一致性(κ=0.6475)。结论:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中病理诊断为宫颈病变的样本中均呈高表达,对筛查潜在的宫颈病变具有重要意义,其中p16INK4A的筛查效能优于HPV16E7/HPV18E6mRNA;p16INK4A能间接反映HPV的转录活性,在ASCUS的分流中有重要意义,且可视性的p16INK4A免疫染色比HPV检测更直观。