血小板裂解液对人脐带间充质干细胞体外成软骨分化的影响

目的探讨血小板裂解液(platelet lysate,PL)在体外定向诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)分化成软骨细胞中的作用。方法取健康产妇自愿捐赠脐带,采用胶原酶消化法分离hUCMSCs,体外培养扩增,流式细胞仪进行细胞表型鉴定。根据加入诱导培养基成分不同将实验分为以下3组:A组为H-DMEM培养基、10%FBS及10%PL,B组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C及1%胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS),C组为H-DMEM培养基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50μg/mL维生素C、1%ITS及10%PL。诱导培养2周,甲苯胺蓝染色检测各组软骨细胞基质的分泌,免疫荧光检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,半定量RT-PCR检测蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原表达。结果分离得到的hUCMSCs不表达造血细胞的表面标记CD45、CD34和HLA-DR,而表达黏附分子和MSCs表面标记CD44、CD105和CD146。甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光染色示C组呈阳性,B组呈弱阳性,而A组均呈阴性。半定量RT-PCR检测示Aggrecan和Ⅱ型胶原在B、C组中均有表达,A组中未见表达;C组Aggrecan mRNA和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论单纯10%PL不能诱导hUCMSCs成软骨分化,但它可当作成软骨诱导培养基的辅助添加剂,对hUCMSCs成软骨分化有明显促进作用,为构建组织工程软骨提供了新的可利用条件。     

成人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的 建立临床成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为软骨细胞的途径。方法抽取成人骨髓，Percol密度梯度离心法进行体外培养，贴壁细胞传代，取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂地塞米松、维生素C和不同剂量转化生长因子-β(TGF-β)，培养16d后,在倒置显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝染色蛋白多糖，逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学(SABC法)检测Ⅱ型胶原表达，诱导后MSCs与新型材料聚乳酸和羟基乙醇共聚物(PL-GA)复合。结果 Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的。MSCs；5、10ng TGF-β诱导分化的MSCs生长迅速。呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性，MSCs对材料PL-GA黏附力强。结论 可以从成人骨髓中培养出MSCs，并可定向诱导分化为软骨细胞，5～10ng TGF-β为最佳诱导剂量，成人MSCs可用作临床自体软骨组织工程种子细胞。     

不同浓度转化生长因子-β1对人骨髓间充质干细胞/海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSCS）体外定向分化为软骨样组织的可行性以及不同浓度TGF-β1对人MSCs／海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响。方法将体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞与海藻酸钠结合，制成MSCs／海藻酸钠复合物，诱导培养液中添加不同浓度TGF-β1，在培养的不同时间进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学，原位杂交，蛋白多糖的特殊染色，以及蛋白多糖的定量检测。结果细胞在海藻酸钠中生长良好，可见细胞分裂增殖，形成同源细胞团。10μg／L诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，基质中有红染的黏多糖物质的堆积，蛋白多糖定量检测均高于其他实验组（P〈0.05）。结论TGF-β1浓度过低不能诱导软骨形成，而浓度过高则不利于软骨形成，10μg／L是体外诱导软骨形成的适宜浓度。海藻酸钠是运载MSCs的理想载体和支架。     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体制备及复合骨髓基质干细胞成软骨的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔载体作为新型组织工程软骨载体的可行性。方法观察-80℃冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠载体的孔径、孔隙率、交通孔和密度;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(MSCs),MTT检测MSCs在载体上的黏附率及多孔载体对细胞增殖功能的影响;兔MSCs经转化生长因子β1(TGF-β1)诱导7d后免疫组化检测Ⅱ型胶原、S-100蛋白表达;诱导后的MSCs与载体复合后植入裸鼠肌袋内,分别于术后2、4周取材进行组织学观察。结果载体孔径为230±30μm,孔隙率为79%,密度为11.50±0.36(μg/mm3);细胞在载体上黏附率87.5%;载体可轻度促进MSCs增殖;经TGF-β1诱导7d后MSCsⅡ型胶原、S-100蛋白免疫组化染色阳性;诱导后的MSCs在体内生长增殖良好,4周时可见新生软骨组织形成。结论该载体具有良好的孔径、孔隙率,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生载体。     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复兔关节软骨缺损

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)复合纤维蛋白凝胶(FG)对兔关节软骨缺损的修复效果。方法12只兔24个膝关节按左右分为实验组与对照组,抽取兔骨髓,密度梯度离心法分离间充质干细胞并行体外培养扩增,实验组以MSCs与FG及转化生长因子β1(TGFβ1)复合后填充到兔膝关节全厚软骨缺损模型中,而对照组以FG/TGFβ1填充,于术后12周取材,观察检测软骨缺损的修复情况。结果术后12周,实验组缺损由类透明软骨或透明软骨修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝异染性明显,修复面较平整光滑;而对照组则以纤维软骨及纤维组织修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。结论MSCs复合FG及TGFβ1能够修复兔关节软骨缺损。     

低氧环境和生长分化因子-5联合诱导促进人骨髓基质干细胞分化成软骨细胞的研究

目的 探讨低氧环境下生长分化因子-5 (GDF-5)诱导人骨髓基质干细胞(hBMSCs)“自组装”形成工程化软骨的可行性和有效性。方法 分离培养hBMSCs,流式细胞学方法鉴定。将hBMSCs用含100 ng/mL GDF-5软骨诱导液(CM)分别在低氧（A组）和正常氧（B组）环境下诱导培养3周,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和Aggrecan表达情况。将A、B两组hBMSCs消化后,按一定密度接种于2％琼脂糖包被的24孔板,在不同氧浓度下CM继续诱导3周,免疫组化法检测组织Ⅰ、Ⅱ型胶原表达,甲苯胺蓝染色检测葡萄糖胺聚糖(GAG)表达。结果 hBMSCs呈梭形漩涡状生长,高表达CD44、CD29,不表达CD45分子。诱导5d后A组细胞较B组明显增殖,诱导10dA组细胞体积较B组小。含GDF-5的CM诱导hBMSCs 3周后,Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA表达阳性,A组Ⅱ型胶原和Aggrecan表达量较B组均明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。GDF-5诱导hBMSCs可“自组装”形成一定形状大小类软骨样组织,A组Ⅱ型胶原表达较B组增加,A组Ⅰ型胶原表达量下降,B组表达阳性;A组甲苯胺蓝染色异染加深。结论 低氧促进GDF-5诱导hBMSCs向软骨分化,低氧环境下GDF-5诱导软骨分化的hBMSCs“自组装”形成的工程化软骨更具有软骨表型。     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究

[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达最为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

骨软骨复合体修复软骨及软骨下骨缺损

目的探讨以诱导的兔骨髓基质细胞与双层PLGA支架构建组织工程骨软骨复合体,修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的方法及结果。方法健康新西兰兔28只,分为三组。A组为常规培养MSCs(10只),B组为诱导培养MSCs(10只),C组为自体骨软骨块移植(8只)。密度梯度离心法获得骨髓基质干细胞(marrow-derivedstromalcells,MSCs),分别使用常规培养液和成软骨诱导条件培养液进行体外扩增传代。提取MSCs及关节软骨细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。扫描电镜观察MSCs在PLGA双层支架上的复合与分布情况。A、B组MSCs分别与PLGA双层支架构建直径3.5mm、高3.0mm的骨软骨复合体,植入股骨髁髌骨滑车同比例骨软骨缺损区,术后第4、8、16、24周取材,进行大体观察、组织学检查和评分。结果RT-PCR见常规培养MSCs表达Ⅰ型胶原,无Ⅱ型胶原表达;诱导后MSCs表达Ⅰ、Ⅱ型胶原。扫描电镜观察MSCs在PLGA支架黏附生长良好,孔隙深处可见细胞分布。B组标本术后24周大体观察与正常软骨无明显差别,组织学检查为成熟的类透明软骨组织(4/6),优于A组(1/4)。结论MSCs具有成骨和成软骨潜能,可在基于细胞的软骨修复中作为种子细胞与双层PLGA构建组织工程骨软骨复合体,该复合体在实验动物模型中可修复关节软骨和软骨下骨缺损。     

rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs诱导分化为软骨细胞的研究

目的 探讨rAAV2-hTGF-β1体外转染犬MSCs定向分化为软骨细胞的可行性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSCs,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,流式细胞技术鉴定其表面标记物.取第三代MSCs,分别以感染复数(MOI)为1×105病毒基因数/细胞v.g./cell)、5×105v.g./cell的rAAV2-hTGF-β1进行转染.培养后定期取各组细胞进行相关检测.Western blot检测hTGF-β1的表达,ELISA法测定hTGF-β1的含量,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达,免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达.结果 原代及传代培养的MSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.细胞表面抗原CD29、CD44、CD105表达阳性,CD34、CD45表达阴性.rAAV2-hTGF-β1转染MSCs后,Western blot法检测到目的 蛋白hTGF-β1稳定表达:ELISA法检测转染组MSCs培养上清液中的hTGF-β1表达,且随时间的延长,各组hTGF-β1浓度逐渐增加,MOI 5×105组表达量明显高于MOI 1×105组(P<0.01);RT-PCR检测到各转染组Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA表达,免疫细胞化学法检测转染组细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达,且高MOI值组表达强度明显高于低MOI值组.结论 rAAV2-hTGF-β1转染犬MSCs后可定向分化为软骨细胞,作为软骨组织工程的种子细胞是可行的.     

聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸软骨支架复合自体骨髓间充质干细胞构建组织工程化人工关节软骨

目的：应用组织工程学技术,体外初步构建组织工程化人工关节软骨。方法：制备三维多孔软骨支架材料CPP／PLLA,体外诱导兔MSCs向软骨细胞表型分化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,将诱导细胞与软骨支架材料CPP／PLLA复合,体外培养构建人工关节软骨,1周后终止培养,扫描电镜观察组织工程化人工软骨的微观结构;同时将构建人工软骨移植于兔大腿皮下,3周后处死动物,甲苯胺蓝染色观察。结果：扫描电镜观察可见该复合材料CPP／PLLA为高孔隙率的网状、连通、微孔结构,微孔分布均匀,孔径大小为300～400μm之间;兔MSCs经体外软骨表型定向诱导后,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。诱导后的MSCs可在支架材料内良好贴附生长,细胞被分泌的胶原基质包裹;从体内获取的培养物组织切片观察可见大量的软骨细胞生成,甲苯胺蓝染色阳性。结论：经软骨起源诱导后的MSCs与CPP／PLLA复合培养可以构建自体软骨移植的替代物,为应用软骨组织工程方法修复关节软骨缺损和功能重建提供一种新材料,具有较大的潜在应用价值。     

TGF-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）在TGF-β2诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法：抽取兔髂骨骨髓液3-4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导f含TGF-β2 10ng／ml、地塞米松10^-7M、维生素C50μmol／L）,对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21天后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。结论：TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究

目的 在体外建立稳定有效的软骨细胞分化模型.方法 复苏ATDC5细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,细胞90%融合时分别用不含Vc和含Vc的诱导培养基培养进行分化诱导.诱导21 d,阿力新蓝染色,RT-PCR检测Ⅱ、Ⅹ型胶原表达进行鉴定.结果 含50 μg/mL Vc的诱导培养基诱导1 周便可见明显的软骨小结,细胞产生软骨基质明显增多,Ⅱ及Ⅹ型胶原表达明显增高,且Ⅹ型胶原表达呈提前.结论 利用ATDC5细胞系可成功建立软骨细胞分化体外模型.     

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

骨髓间质干细胞向软骨细胞表型定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的猪骨髓间质干细胞（Bone Marrow Stem Cells,MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法 取成年崇明长枫杂交猪髂骨骨髓5ml，在低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以高糖DMEM无血清特定培养液诱导（含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF－β1 10ng/ml)，在相关显微镜和电镜下进行观察，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形转变，透视电镜观察见大量扩张粗面内质网、高尔基体、线粒体。诱导培养后第7，14dⅡ型胶原免疫组化阳性，同时原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达呈阳性。结论 MSCs在特定培养液诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软膏特异性基质，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源的应用前景。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

羟基磷灰石/二氧化锆复合材料颗粒对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 采用分子生物学方法评价羟基磷灰石/二氧化锆(HA/ZrO2)复合材料颗粒对兔骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 按不同比例将纳米HA粉体与纳米ZrO2粉体混合在高温下烧结制备HA/ZrO2复合材料颗粒,分离和培养兔MSCs.MTT法检测复合材料颗粒悬液对兔MSCs增殖促进作用,ALP法测定碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ),骨钙蛋白(osteocalcin),骨桥蛋白(osteopontin)mRNA表达.结果 HA和含有HA的复合材料颗粒均对细胞增殖有一定促进作用.Vonkossa染色显示复合材料和纯HA颗粒可使细胞阳染程度降低.细胞在HA和含有HA的复合材料颗粒的成骨诱导培养液中的ALP活性均显著高于常规培养基质及纯ZrO2组(P＜0.05).RT-PCR结果显示复合材料颗粒能够促进collagen Ⅰ和osteocalcin基因的表达.结论 HA/ZrO2复合材料颗粒可促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化.

Abstract：

Objective To evaluate the effect of the HA/ZrO2 composite particle on proliferation and osteogenesis of rabbit mesenchymal stem cells (MSCs) by using molecular biology methods.Methods The HA/ZrO2 composite particles were sintered at high temperature using the powder of HA and ZrO2 with different proportions.MSCs were isolated from rabbits and cultured.The effect of the composite particles on promoting cell proliferation of rabbit MSCs was detected using MTT method.Alkaline phosphatase activities were measured with ALP method.RT-PCR method was applied to measure the expression of collagen Ⅰ , osteocalcin and osteopontin mRNA.Results Pure HA pauicles and composite particles which contain HA promoted MSCs proliferation.Vonkossa staining showed that both pure HA particks and composite particles decreased the degree of positive stain of MSCs.ALP test showed that cell activity in the culture medium that contained pure HA particles or composite particles was significantly higher than that in the conventional culture medium and that contained pure ZrO2 particles (P ＜ 0.05＝.RT-PCR results showed that composite particles promoted the expression of collagen Ⅰ and osteocalcin gene.Conclusion The HA/ZrO2 composite particles promote proliferation and osteogenesis of MSCs.     

Effect of culture duration on chondrogenic preconditioning of equine bone marrow mesenchymal stem cells in self‐assembling peptide hydrogel

Ex vivo induction of chondrogenesis is a promising approach to improve upon the use of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) for cartilage tissue engineering. This study evaluated the potential to induce chondrogenesis with days of culture in chondrogenic medium for MSCs encapsulated in self‐assembling peptide hydrogel. To simulate the transition from preconditioning culture to implantation, MSCs were isolated from self‐assembling peptide hydrogel into an individual cell suspension. Commitment to chondrogenesis was evaluated by seeding preconditioned MSCs into agarose and culturing in the absence of the chondrogenic cytokine transforming growth factor beta (TGFβ). Positive controls consisted of undifferentiated MSCs seeded into agarose and cultured in medium containing TGFβ. Three days of preconditioning was sufficient to produce chondrogenic MSCs that accumulated ～75% more cartilaginous extracellular matrix than positive controls by day 17. However, gene expression of type X collagen was ～65‐fold higher than positive controls, which was attributed to the absence of TGFβ. Potential induction of immunogenicity with preconditioning culture was indicated by expression of major histocompatibility complex class II (MHCII), which was nearly absence in undifferentiated MSCs, and ～7% positive for preconditioned cells. These data demonstrate the potential to generate chondrogenic MSCs with days of self‐assembling peptide hydrogel, and the ability to readily recover an individual cell suspension that is suited for injectable therapies. However, continued exposure to TGFβ may be necessary to prevent hypertrophy indicated by type X collagen expression, while immunogenicity may be a concern for allogeneic applications. © 2018 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 37:1368–1375, 2019.     

Mechanical Stimulation by Ultrasound Enhances Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells in a Fibrin‐Hyaluronic Acid Hydrogel

Chondrogenic differentiation and cartilage tissue formation derived from stem cells are highly dependent on both biological and mechanical factors. This study investigated whether or not fibrin‐hyaluronic acid (HA) coupled with low‐intensity ultrasound (LIUS), a mechanical stimulation, produces an additive or synergistic effect on the chondrogenesis of rabbit mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow. For the purpose of comparison, rabbit MSCs were first cultured in fibrin‐HA or alginate hydrogels, and then subjected to chondrogenic differentiation in chondrogenic‐defined medium for 4 weeks in the presence of either transforming growth factor‐beta3 (TGF‐β3) (10 ng/mL) or LIUS treatment (1.0 MHz and 200 mW/cm²). The resulting samples were evaluated at 1 and 4 weeks by histological observation, chemical assays, and mechanical analysis. The fibrin‐HA hydrogel was found to be more efficient than alginate in promoting chondrogenesis of the MSCs by producing a larger amount of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) and collagen, and engineered constructs made with the hydrogel demonstrated higher mechanical strength. At 4 weeks of tissue culture, the chondrogenesis of the MSCs in fibrin‐HA were shown to be further enhanced by treatment with LIUS, as observed by analyses for the amounts of GAGs and collagen, and mechanical strength testing. In contrast, TGF‐β3, a well‐known chondrogenic inducer, showed a marginal additive effect in the amount of collagen only. These results revealed that LIUS further enhanced chondrogenesis of the MSCs cultured in fibrin‐HA, in vitro, and suggested that the combination of fibrin‐HA and LIUS is a useful tool in constructing high‐quality cartilage tissues from MSCs.