黄芪甲苷对耐药肝癌细胞株HepG2/GCS逆转作用的研究

近年来,葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)在肿瘤多药耐药中的作用逐渐受到重视.我们前期实验已证实GCS基因参与了肝癌细胞HepG2多药耐药的发生,通过基因转染使细胞内GCS基因高表达的肝癌细胞株HepG2/GCS具有多药耐药性[1].本实验观察黄芪甲苷(astragalosideⅣ)对肝癌耐药细胞株HepG2/GCS耐药性的影响,进一步探讨其逆转肿瘤多药耐药的作用机制.     

高转移潜能肝癌细胞株中凋亡相关蛋白的表达及意义

目的 探讨肝癌细胞转移潜能与凋亡敏感性之间的关系.方法 观察不同转移潜能的肝癌细胞株在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及依托泊苷(Etoposide)的作用下的凋亡发生率及Caspase3的活化,Western blot检测bcl-2及IAP家族蛋白在不同转移潜能肝癌细胞株中的表达.结果 TNF-α(10μg/L)作用后48 h,高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3及转移能力最弱的肝癌细胞株SMMC-7721的凋亡率分别为(91.3±6.5)%及(58.8±2.3)%,MHCC97L细胞的凋亡率则位于两者之间(P≤0.01).Etoposide(250 μmol/L)作用后48 h,HCCLM3、MHCC97L及SMMC-772的凋亡发生率分别为(27.0±4.0)%、(34.6±3.8)%及(84.5±1.1)%(P≤0.01).3种细胞株中Caspase3的活性也有明显差异.bcl-2及IAP家族蛋白表达研究中发现XIAP的表达与肝癌细胞的转移潜能成梯度相关.结论 高转移潜能肝癌细胞株耐受多种凋亡刺激,可能与XIAP的过度表达相关.     

5-LOXsiRNA抑制人肝癌HepG-2细胞裸鼠移植瘤的生长并诱导细胞凋亡

目的探讨5-脂氧合酶(5-LOX)siRNA转染的人肝癌HepG-2细胞株裸鼠皮下移植瘤生长的影响及可能的作用机制。方法选取裸鼠18只,将其随机进行分三组:1、对照组(接种正常人肝癌HepG-2细胞株)。2、转染组(接种转染5-LOX-siRNA的人肝癌HepG-2细胞株)。3、空载体组(接种转染空质粒的人肝癌HepG-2细胞株)。观察载瘤小鼠皮下移植瘤生长及小鼠的生存情况,并于接种移植瘤3周后处死载瘤小鼠,记录各组移植瘤体积V及计算肿瘤衰退率,经Western和RTPCR检测通路信号蛋白ERK1/2、MEK1/2及caspase3、bcl-2等凋亡调节因子等表达情况。结果转染组肿瘤平均体积与转染空载体组、正常对照组比较明显减小(P0.01),Western及RT-PCR检测发现转染组caspase3表达量明显增强,ERK1/2、MEK1/2及bcl-2等表达量明显下降(P0.01)。结论抑制5-脂氧合酶的表达可显著抑制肝癌移植瘤的生长,其机制可能与5-LOX通过MEK/ERK途径调节凋亡基因bcl-2 caspase3的表达有关。     

共刺激分子B7-2对小鼠肝癌治疗作用的实验研究

目的　应用转染有小鼠 B7- 2基因片段的肝癌细胞 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠肿瘤生长和消退情况 ,研究共刺激分子 B7- 2对肿瘤的免疫治疗作用。方法　建立 BAL B/ c小鼠转 B7- 2基因肝癌细胞株 H2 2 / B7- 2 ,细胞计数法测定肿瘤细胞体外增殖能力 ;BAL B/ c鼠皮下接种 H2 2 / B7- 2及野生型 H2 2细胞 H2 2 / Wt,以空载体转染细胞 H2 2 / neo为对照 ,建立小鼠肝癌模型 ,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小 ;同源淋巴细胞肿瘤细胞混合培养 (MTL Cs)后测定淋巴细胞增殖指数和 CTLs活性 ,同时测定培养上清 IL- 2、IFNγ,研究 B7- 2分子的抗肿瘤免疫效果。结果　细胞在体外增殖能力一致 (P= 0 .782 ) ;当接种不同肿瘤细胞后 ,三组动物都发生肿瘤 ,接种 H2 2 / B7- 2组肿瘤形成有迟发性 ,并在接种 18d后肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种 H2 2 / Wt和 H2 2 / neo组动物肿瘤都开始缩小 ,但最终不会完全消失 ;接种 H2 2 / Wt和 H2 2 /neo组动物肿瘤呈进行性生长。H2 2 / B7- 2在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导 CTLs的能力明显强于对照细胞 (P<0 .0 5 )。结论　共刺激分子 B7- 2能增强肝癌细胞的免疫原性 ,它在抗肿瘤早期发挥作用。用其治疗肝癌是有效的 ,但不能介导完全和长期的抗肿瘤效应     

肝外胆管癌中bcl-2/Bax的表达及其意义

目的：研究抗凋亡基因bcl-2(B cell lymphoma-2)和促凋亡基因Bax(Bcl-associated x protein)在肝外胆管癌中的表达及意义.方法:用免疫组化S-P法测定41例肝外胆管癌中bcl-2和Bax的表达产物,以13例慢性胆管炎做对照.结果:肝外胆管癌中bcl-2的阳性率为58.54%,高于慢性胆管炎组织的0(P<0.01);而Bax在肝外胆管癌中的阳性率为56.10%,低于慢性胆管炎组织的92.31%(P<0.05).高中分化癌组和无转移组中bcl-2与Bax的阳性率明显高于低分化癌组和转移组(P<0.05).结论:bcl-2和Bax的表达与肝外胆管癌的分化有关,可作为判断胆管癌患者预后的参考指标.     

bcl-2基因表达变化在槲皮素抑制肝细胞癌生长中的作用

目的 探讨三磷酸肌醇(IP3)和bcl-2基因表达变化在槲皮素治疗裸鼠移植人肝细胞癌中的作用.方法 建立裸鼠移植入肝细胞癌模型,对照组腹腔注入含0.4%DMSO的RPMI 1640培养基0.05 ml/(g·d),槲皮素治疗组腹腔注入槲皮素50 mg/(kg·d),3周后观察肝癌生长情况,并应用IP3-[3H]Birtrak Assay试剂盒检测肝癌组织中IR的含量,RT-PCR检测肝癌组织中bcl-2 mRNA的表达,Western blot检测肝癌组织中bcl-2蛋白的表达.结果 槲皮素治疗组移植瘤体积和重量均明显小于或轻于对照组[体积:(15.8±10.1)mm3比(52.3±26.5)mm3,重量:(44.8±10.4)mg比(91.3±31.4)mg,P<0.01];肝癌组织中IP3含量明显低于对照组[(13.4±1.4)pmol/mg prot比(35.3±6.6)pmol/mg prot,P<0.01],bcl-2 mRNA表达低于对照组但差异无统计学意义[RI(相对灰度与面积之积):0.55±0.05比0.79±0.19,P>0.05],bcl-2蛋白的表达则明显低于对照组[RI:1.07±0.12比6.69±1.80,P<0.01].结论 槲皮素能减少IP3的生成,下调肝癌组织中bcl-2基因的表达,抑制裸鼠移植人肝细胞癌的生长.     

胰腺癌细胞凋亡与bcl-2,bax基因的表达

目的探讨胰腺癌组织中的bcl-2和bax的表达及bcl-2/bax比值与胰腺癌细胞凋亡的关系.方法对30例胰腺癌标本应用免疫组化SP方法测定胰腺癌切片中的凋亡抑制基因bcl-2和凋亡促进基因bax的表达;同时应用TUNEL法测定胰腺癌细胞原位凋亡情况.结果高分化腺癌的凋亡指数(AI)为(5.70±1.21)%;中低分化腺癌为(6.80±2.01)%.AI与bcl-2/bax比值呈负相关关系(r=- 0.5583,P<0.05 ).结论 bcl-2和bax在胰腺癌细胞凋亡调节过程中起着重要作用.     

慢病毒介导MAT2A及2B双重小干扰RNA对肝癌的抑制作用

目的 观察慢病毒载体携带的针对MAT2A和MAT2B基因双重小干扰RNA(dual siRNA)对肝癌的抑制作用.方法 分别构建靶向MAT2A、MAT2B基因的siRNA质粒,酶切、连接,构建同时针对MAT2A和MAT2B基因的慢病毒载体siMAT2A/2B,感染肝癌HepG2细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定MAT2A和MAT2B mRNA水平,细胞计数;流式细胞仪测定细胞凋亡,测定作用前后肝癌细胞内S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)的水平.结果 成功构建慢病毒载体携带的针对MAT2A和MAT2B基因双重小干扰RNA,LV-siMAT2A/2B同时抑制肝癌MAT2A和MAT2B基因表达分别达到89.5%和97.8%,肝癌HepG2细胞生长抑制率大于50%,促进细胞凋亡,提高肝癌细胞内SAMe的水平上升了2倍.结论 同时抑制肝癌内MAT2A、MAT2B基因的表达可以抑制肝癌的生长.     

bcl-2及其重要功能结构域在调节成纤维细胞NIH3T3凋亡中的研究

目的 以成纤维细胞NIH3tT13作为细胞模型,探讨bel-2 Loop Domain结构域在成纤维细胞凋亡中的作用地位.方法 构建正常和Loop Domain结构域突变bcl-2基因的真核表达质粒,用于成纤维细胞转染;脂质体介导,分别将(1)空载体质粒(2)携带bcl-2基因质粒和携带突变基因的质粒转染成纤维细胞(NIH3T3),转染后用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激NIH3T3细胞诱导凋亡,应用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞凋亡,应用华联小鼠全基因表达谱芯片检测各组细胞基因表达谱的变化.结果 成功构建bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体;成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞;各组转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡,FCM检测发现,TNF-α刺激细胞17 h后,NIH3T3未转染细胞凋亡明显增加,细胞凋亡率为(53.18 ±8.18)%,NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率明显下调;NIH3T3转染突变bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3转染突变bcl-2质粒组比较细胞凋亡率明显上调;基因芯片检测发现:转染bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因与转染空质粒组下调,转染Loopdomain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因比转染bcl-2基因的NIH3T3细胞上调.结论 证实bcl-2基因Loop domain结构域突变对bcl-2基因功能产生明显影响,bcl-2基因Loop domain结构域突变使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化.     

小鼠乳腺癌中p53与bcl-2/bax基因表达的相关性研究

目的探讨p53基因和bcl-2/bax基因在乳腺癌发病机制中的作用以及它们之间的相互关系。方法以小鼠乳腺癌BCML-TA299可移植模型为研究对象,用免疫组织化学染色法观测α-干扰素(INF-α)干扰后p53基因与bcl-2/bax表达的关系。结果实验性乳腺癌BCML-TA299治疗组荷瘤鼠生存期较对照组延长,且随着时间的推延治疗组肿瘤的体积明显低于对照组的肿瘤体积;治疗组与对照组比较,肺转移率低。对照组p53蛋白阳性表达率为92.01±0.48,而治疗组中p53呈阴性表达。对照组瘤组织bcl-2蛋白表达为50.21±0.52,bax蛋白表达为12.08±0.13;治疗组瘤组织bcl-2蛋白表达为12.01±0.2,bax蛋白表达为48.19±0.57。对照组p53蛋白表达与bcl- 2呈正相关,而与bax呈负相关(P<0.05);治疗组中p53呈阴性表达,bcl-2和bax表达与对照组结果相反。结论bcl-2和bax的表达受p53调节。p53、bcl-2/bax在乳腺癌发病机制中起着较重要的作用。     

促血管生成素在原位种植肝癌组织中的表达及其意义

目的　研究促血管生成素基因在大鼠原位种植肝癌模型中的表达及其与肝癌新生血管之间的关系。方法　采用Walker2 5 6癌肉瘤接种 40只Wistar大鼠制作原位种植肝癌模型 ,用微血管计数以标志肿瘤新生血管。采用原位杂交法检测促血管生成素基因的表达。结果　Walker2 5 6癌肉瘤接种后 1,2 ,3周肿瘤微血管密度分别为 (15± 4.3 ) /Hp ,(17± 3 .6) /Hp和 (4 5± 7.8) /Hp。接种后3周较前 2周有显著性增加 (均P <0 .0 5 )。无癌肝脏组织和肝癌组织中都有大量促血管生成素 -1(ang 1)mRNA表达 ,且两者差异无显著性 (T =3 .2 14 ,P =0 .12 6)。无癌肝脏组织中无促血管生成素 -2 (ang 2 )mRNA表达 ,而肝癌组织中有大量ang 2mRNA表达且与肿瘤微血管密度呈正相关。结论　ang 2可能对原位接种肝癌中新生血管的形成有一定作用。     

乙型肝炎病毒基因型B、C与肝细胞性肝癌临床病理的研究

目的 探讨HBV基因型B、C与肝癌临床病理方面的关联性.方法 对58名手术切除肝癌病人的血清样本进行基因型检测.结果 HBV基因型B、C的感染率分别为31%(18/58)、69%(40/58),基因型B病人肝硬化的发病率低于基因型C(33% vs 70%,P=0.01).基因型B、C多发肿瘤的发病率为28%、7.5%(P=0.04),伴有血管侵犯的发病率为33%、10%(p=0.03).结论 HBV基因型B相关性肝癌与HBV基因型C相关性肝癌相比,肝硬化发生率低,多发肿瘤及血管侵犯发病率高.造成了肝癌病人的复发及预后的差异性.     

乳腺癌病理生物学特性与多肿瘤基因表达的关系

目的 观察多肿瘤基因在乳腺癌组织中的表达,探讨其与乳腺癌病理生物学特性的关系.方法 采用免疫组织化学SP染色法对120例乳腺癌组织中多肿瘤基因的表达进行检测[雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、表皮生长因子受体(C-erB-2)、p53、转移抑制基因(mn23)、bcl-2、增殖细胞核抗原(PCNA)、多药耐药蛋白(MRP)],分析其与乳腺癌病理生物学特性的关系.结果 p53、bcl-2的表达在不同乳腺癌激素受体状态中差异有统计学意义,且与ER、PR的表达有显著相关性:p53在ER(-)、PR(-)的乳腺癌中呈现高表达,在ER(+)、PR(+)的乳腺癌中呈现低表达(P<0.01);而bcl-2则相反(P<0.01).bcl-2的表达与月经状态有关,在绝经前乳腺癌组织中的表达明显高于绝经后乳腺癌(P<0.01).PCNA的表达与肿瘤的大小相关,在直径较大的肿瘤(>3 cm)中的表达显著高于直径较小的肿瘤(≤3 cm,P<0.01).结论 p53、bcl-2的表达与ER、PR的状态相关,可作为判断乳腺癌生物学特性和预后的重要指标.     

WTp53基因联合双自杀基因介入途径治疗肝癌的实验研究

目的 探讨经介入途径多疗法、多基因联合治疗肝癌的可行性.方法 分别制备pCMV-p53质粒-脂质体复合物及浓缩的TK-CD逆转录病毒上清.新西兰大白兔50只建立兔肝癌模型.根据B超及CT扫描结果,选取肿瘤直径约2 cm的荷瘤兔45只,随机分为5组,每组9只.第1组为单纯生理盐水治疗组(对照组);第2组为单纯超液化碘油栓塞组;第3组为超液化碘油+p53组;第4组为超液化碘油+TK/CD组;第5组为超液化碘油+p53+ TK/CD组.经股动脉肝动脉插管成功并造影确定靶血管后,1.2F微导管超选择插管至肿瘤供血动脉,透视监视下按分组缓慢灌注实验药品.各组瘤兔分别于介入术前、术后10 d行B超和CT扫描,检测肿瘤最大径(a)和最小径(b),计算肿瘤体积(V=ab2/2)及肿瘤生长率.介入手术后8周,动物脱颈处死(包括观察期内自然死亡的),行常规病理检查及生存期的观测.结果 成功建立兔肝癌模型,插管及介入治疗顺利.治疗前各组肿瘤体积无统计学差异(P＞0.05).介入治疗后10 d对肝脏肿瘤体积变化进行分析显示,与对照组比较,各治疗均对肿瘤的生长具有显著抑制作用(P＜0.05),其中碘油栓塞+联合基因治疗组的效果最为显著.2×2析因分析表明:p53基因、TK/CD基因与碘油栓塞结合均有明显的抑制肿瘤生长的作用,但二者之间无交互协同作用(P=0.793).与对照组比较各治疗组动物生存期延长,差异均有统计学意义(P＜0.01),其中多疗法、多基因联合治疗组效果最为明显.结论 介入疗法可以为基因治疗提供理想的给药方法及途径.碘油栓塞、WTp53基因与TK/GCV、CD/5-Fc系统联合应用可以有效抑制肿瘤生长,延长动物生存期.     

腺病毒介导反义c-myc基因抑制人肝癌细胞生长的研究

目的观察重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)对体外培养人肝癌细胞的生长抑制作用和裸鼠体内移植肝肿瘤的治疗效果.方法Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后,观察细胞生长形态变化,通过细胞生长曲线、流式细胞仪分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)分析Ad-ASmyc对人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204细胞生长、c-myc和bcl-2基因表达的影响;裸鼠皮下移植瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc(1×109pfu-A组,1×108pfu-B组,1×107pfu-C组)抑制裸鼠肿瘤生长的差异.结果Ad-ASmyc可高效转导人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204,抑制细胞生长(抑制率分别为48.72%和56.88%),诱导肝癌细胞G1期阻滞和凋亡,c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白水平下降;瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc均可明显抑制裸鼠皮下移植肿瘤生长,抑制率分别为47.1%、77.3%和82.6%(与对照组比较,P＜0.01).结论重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制,瘤内注射Ad-ASmyc治疗裸鼠皮下移植肝癌有效.     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

葡萄糖神经酰胺合成酶在肝癌细胞多药耐药中的作用机制

近年来葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)在肿瘤多药耐药(MDR)中的作用逐渐受到重视.我们在构建GCS基因真核表达质粒pEGFP-GCS的基础上,应用基因转染技术使GCS基因在肝癌细胞HepG2内高表达,观察HepG2细胞内多药耐药基因MDR1的表达,以及细胞耐药性的变化,探讨GCS基因参与肝癌细胞HepG2多药耐药的机制.     

抑癌基因DLC-1在肿瘤发生中的作用及其表达调控研究进展

DLC-1(frequently deleted in liver cancer 1)基因是一种肿瘤抑制基因,是从肝癌细胞系中首先分离报道的.DLC一1基因在许多肿瘤,如肝癌、非小细胞性肺癌、前列腺癌、乳腺癌等中均表达缺失或下调,而其表达的恢复能够抑制肿瘤细胞的增殖、生长和转移,证实该基因在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的生物学作用.就DLC-1基因的结构、功能及其在肿瘤中的相关研究作一综述.     

甲胎蛋白与肝癌细胞耐受肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究进展

甲胎蛋白(AFP)是肝癌细胞合成的特异性很高的蛋白质,在临床上被认为是诊断肝癌的金标准.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是近年来发现的极具潜力的新型抗肿瘤药物,目前已经通过美国食品和药物管理局二期临床试验.体外研究结果表明,几乎所有的肝细胞肝癌(HCC)细胞株均对TRAIL表现出不同的耐药性[1-2],使其在肝癌的治疗方面作用有限;越来越多的证据显示,肝癌细胞合成的具有高特异性的AFP在对抗TRAIL诱导凋亡途径中的机制中起重要作用,其具体机制尚不清楚.因此探讨AFP在对抗TRAIL诱导凋亡途径中的机制,将给肝癌的治疗带来曙光.现就AFP对TRAIL诱导凋亡途径中相关分子的作用及其产生的对抗凋亡的影响进行阐述.     

血管内皮生长因子936*T/C基因多态性与原发性肝癌的关系

目的 通过研究血管内皮生长因子(VEGF)936*T/C基因多态性与原发性肝癌之间的关系,了解该基因多态性对原发性肝癌生成及发展的影响.方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法 检测原发性肝癌及正常对照的VEGF 936*T/C基因型.结果 原发性肝癌病人VEGF 936*T/C基因型或等位基因与对照组相比无差异(精确概率法计算基因型P=0.275;卡方检验等位基因χ2=0.877,P=0.349).在肿瘤直径≥8 cm的病人C/C基因型和c等位基因比例(66.7%和82.0%)明显大于肿瘤直径<8 cm病人的比例(40.0%和65.0%),两者差异有统计学意义(C/C基因型χ2=4.722,P=0.029;C等位基因χ2=5.393,P=0.020).结论 VEGF936*C/C基因型或936*C等位基因与原发性肝癌的生成无关,但VEGF 936*C/C基因型和C等位基因有助促进肿瘤的生长.