直接测序联合多重连接依赖探针扩增法检测家族性腺瘤性息肉病APC基因胚系突变

目的 研究中国家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者APC基因胚系突变的特点.方法 对来自北京、河北、河南、安徽、内蒙古、山西、福建等地区的14个FAP家系先证者用直接测序法进行APC基因突变检测,对突变检测阴性者应用多重连接依赖探针扩增(MLPA)技术进行APE基因大片段缺失检测.结果 14例先证者中9例(64.3%)检测出APC基因微小突变,其中移码突变6例,剪接区突变2例,无义突变1例;2例(14.3%)检测出APC基因大片段缺失,微小突变与大片段缺失的总检出率为78.6%.c.2336-2337insT、c.3923-3929delAAGAAAA、c.532-2A>T和c.4179-4180GAdelinsT等4个微小突变和外显子11、10A缺失、外显子15 start缺失等2个大片段缺失为首次报道.结论 中国FAP患者APC基因的胚系突变类型多样,以移码突变居多,突变位点以第15外显子居多;直接测序法联合MLPA法检测大片段缺失可提高APC基因突变的检出率.     

多重竞争性荧光PCR检测X连锁Alport综合征大片段缺失突变

目的 探讨多重竞争性荧光PCR在X连锁Alport综合征分子诊断中的应用。方法 选择20例在北京大学第一医院确诊且未进行基因诊断的X连锁Alport综合征患者为研究对象,同时选择2例经多重连接依赖性探针扩增技术检测到COL4A5基因大片段缺失突变的患者作为阳性对照和1例经肾活检组织电子显微镜检查证实非Alport综合征的男性作为正常对照。首先应用多重竞争性荧光PCR技术扩增COL4A5基因53个外显子和4个参照基因,对于检测到COL4A5基因缺失第1外显子者,进而应用相同技术扩增COL4A5基因外显子1~4、COL4A6基因外显子1~4、两基因共用启动子以及3个参照基因;对于检测到拷贝数缺失者,应用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增后的PCR产物或直接测序。结果 两例阳性对照应用多重竞争性荧光PCR技术检测到的COL4A5基因缺失突变与应用多重连接依赖性探针扩增技术检测到的COL4A5基因缺失突变一致。20例患者中6例(30%)明确了基因型,其中2例患者具有累及COL4A5和COL4A6两个基因5'端的大片段缺失,2例患者具有累及COL4A5基因30个外显子以上的大片段缺失,1例患者具有累及COL4A5基因至少1个外显子的大片段缺失,1例患者具有COL4A5基因缺失13个碱基的小的缺失突变,未检测到重复突变。结论 多重竞争性荧光PCR技术可用于检测X连锁 Alport 综合征大片段缺失突变,是对该病分子诊断检测方法的重要补充。     

河北地区55例苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测与分析

目的 了解河北地区苯丙酮尿症(PKU)患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变情况,分析该地区PAH基因的突变谱及突变特点.方法 联合应用PAH基因全部外显子及外显子-内含子交界区扩增测序和多重连接依赖式探针扩增(MLPA)方法,对2007年9月至2009年7月就诊的55例来自河北地区的PKU患者进行PAH基因点突变和拷贝数改变的检测.对发现大片段缺失的个体,用跨越断裂位点(Gap) -PCR-测序方法确定断裂点精确位置.结果 110个PAH等位基因中检出突变等位基因108个,突变检出率为98.2％.共发现PAH基因突变41种,涉及11个外显子,包括错义突变24种、无义突变7种、剪接位点突变7种、小的缺失1种和大片段缺失2种,其中4种错义突变(p.Pro147ku,p.Gly289Arg,p.Phe392Ser,p.Ile421Thr)和2种大片段缺失突变(- 4163_ - 406del和- 1932_+ 3402del)为国际首次报道.55例患者中以下3种突变所占比例最高:p.Arg243Gln(12.7％)、c.611A ＞G(11.8％)和c.1197A ＞T(9.1％).结论 中国河北地区PKU患者中PAH基因的突变分布广泛;突变类型大部分为单碱基替换,但是大片段缺失也占一定比例.     

早发型帕金森病DJ-1基因突变的分析

目的:分析广西地区早发型帕金森病(Parkinsion's disease,PD)患者及常染色体隐性遗传早发型帕金森病(autosomal recessive early-onset Parkinsion's disease,AREP)家系患者DJ-1基因外显子的突变特点,探讨DJ-1基因外显子的突变与广西地区PD关系.方法:应用聚合酶链式反应(PCR)、单链构象多态性(SSCP)及DNA测序等技术查找DJ-1基因缺失突变及点突变.结果:45例早发型散发性PD患者和12例分别来自5个常染色体隐性遗传早发型PD家系的DJ-1基因的2～7号外显子全部被成功扩增,未见大片段缺失.产物经SSCP方法和测序检测,未见点突变与缺失突变.结论:DJ-1基因的突变不是广西地区早发型PD患者的发病的危险因素.     

眼皮肤白化病Ⅱ型产前基因诊断研究及二种P基因新突变

目的对1例眼皮肤白化病（OCA）患儿进行基于DNA的分型诊断,并在此基础上进行OCA产前基因诊断。方法应用PCR技术、DNA序列测定技术和变性高效液相层析（DHPLC）技术,分析患儿及其父母的OCA相关基因,确定患儿的分型诊断和基因型后,于其母孕20周时取羊水,以DNA序列测定技术进行OCA产前基因诊断。结果先证者’rYR基因未见突变,1对P基因分别存在N476D和Y827H突变。群体中100名表型正常者中未见此2种突变等位基因。胎儿获得了母源性N476D突变,未获得父源性Y827H突变,推测胎儿为表型正常的致病基因携带者。胎儿出生后表型正常,与产前基因诊断结果相符。结论成功开展了1例OCA2产前基因诊断并发现2种致病性P基因新突变N476D和Y827H,对今后开展该病的基础研究和预防与优生工作具有重要意义。     

家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究

目的: 通过聚合酶链式反应(PCR)、基因测序技术及TDI-FP技术,检测散发性与家族性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性,探讨Parkin基因突变在PD发病机制中的作用,同时建立一种新的突变检测方法.方法: 以36例家族性及114例散发性PD患者为实验对象,150名正常健康人为阴性对照,通过PCR扩增含Parkin基因4号外显子的DNA片段,电泳分析初次筛选片段缺失者.基因测序技术对无缺失片段进行克隆、测序,筛选出突变型及野生型.最后应用TDI-FP技术检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值,鉴定Parkin基因4号外显子的基因点突变型.结果: 在36例家族性PD患者中共发现10例4号外显子缺失突变,占27%,点突变有4例,占11%;114例散发性PD患者中仅有2例4号外显子缺失突变,占1%,而点突变则有48例,占42%.150例阴性对照组中无缺失突变,点突变10例,占6%.结论: Parkin基因突变可能是PD发病的重要因素之一,而散发性与家族性帕金森病具有不同的突变类型,可能与其具有不同的发病机制相关联.     

Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病基因诊断与基因突变情况的调查

目的：(1) 建立Ⅰ型常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKDⅠ)的基因诊断方法;(2) 寻找具有普遍意义的突变方式,以优化基因诊断。方法：(1) 采用Southern杂交和 PCR 方法, 调查ADPKDⅠ基因3′端单拷贝区突变情况;(2) PCR扩增分析微卫星SM7。结果：将AH4与16例患者的基因组DNA进行Southern杂交后, 均显示有正常的15 kb的杂交片段。对27例患者ADPKD Ⅰ基因3′端AH4和JH14两探针间的5.72 kb 基因组DNA行PCR扩增后,未发现5.5 kb基因组DNA缺失。109名正常人SM7 PCR扩增显示,其多态信息含量(PIC)值为0.76,3个家系的SM7 等位片段与疾病基因连锁关系明确。结论：在汉族中：(1) ADPKDⅠ基因3′ 端单拷贝区无常见性大片段基因组DNA缺失类突变;(2) SM7所含PIC 较高,用其可在70％？80％的ADPKDⅠ家系中作出基因诊断。     

97例线粒体肌病/脑肌病患者的线粒体DNA突变分析

目的 探讨我国不同临床类型的线粒体脑肌病的线粒体DNA(mtDNA)突变特点以及基因型和表型之间的相关性.方法 对经临床和病理诊断为线粒体肌病/线粒体脑肌病的97例患者,提取其肌肉和/(或)白细胞mtDNA,用Southern杂交检测mtDNA的大片段缺失、以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测常见类型的点突变(包括A3243G、A8344G、T8993G、　T8993C、T3271C突变)、并对部分患者进行mtDNA伞长测序寻找有无其他的突变位点.结果 97例患者中有81例患者存在mtDNA突变,突变类型包括单一的大片段缺失21例,多发的大片段缺失4例,A3243G突变43例,A8344G突变6例,T8993G、T8993C、T3271C突变各1例.KSS/CPEO与单发的mtDNA大片段缺失相关、MELAS与A3243G点突变、MERRF与A8344G点突变、母系遗传的Leigh　病与8993位点的突变相关.另外在4例线粒体肌病患者中发现细胞色素b编码基因A15316G　(T194A)、G15221A(D159N),ATPase6编码基因G9196A(D224N)和16SrRNA C2835T突变各1例.结论 国人不同类型线粒体肭肌病的mtDNA突变类型与国外外的报道道基本一致.虽然线粒体脑肌病的临床表刑和基因型之间有一定的相关件,但不同的基因型和临床表型之间也存在一定的交叉,反映了线粒体病的异质性特点.     

杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段的研究

目的:验证杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段.方法:采用PCR、PAGE电泳和变性高效液相色谱分析的方法,对中国人表皮松解性掌跖角化症致病基因KRT9第1外显子的杂合的碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)进行实验验证.结果:KRT9基因第1外显子碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)杂合子的PCR产物,本身包含2种异源双链DNA片段和2种同源双链DNA片段,不需要经过额外的变性、退火处理.结论:在用DGGE、TGGE、DHPLC和HA等需要形成杂合双链体的基因突变检测技术进行突变检测时,如果突变为杂合子,则PCR产物可以直接进行突变检测,不需要预先加热/冷却等预处理以形成异源双链DNA分子.     

家族性帕金森病Parkin基因外显子缺失突变

目的: 研究Parkin基因外显子缺失突变与中国家族性帕金森病(PD)发病的关系,探讨Parkin基因缺失突变在家族性PD发病机制中的作用及与临床特点、手术疗效之间的关系.方法: 家族性PD患者36例为研究对象,正常人20例作为对照,提取外周血白细胞基因组DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测Parkin基因外显子4,6,7,10缺失情况,观察外显子的缺失分布及缺失率,并结合PD患者的手术疗效分析.结果: 家族性PD患者36例有10例外显子缺失突变,其中外显子4缺失8例,6和7缺失各1例,缺失突变率为27.8%,外显子10未发现异常,对照组中无缺失突变;有外显子缺失突变患者的手术疗效较好.结论: Parkin基因外显子4,6,7缺失突变是我国家族性PD的致病原因之一,PD患者的手术效果与Parkin基因外显子缺失突变与否有关.     

Marfan综合征FBN1基因新的剪接位点的置换突变

目的 对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白-1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变.方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质.用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变.结果 发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29 4A＞T).结论 FBN1的Intron29 4A＞T可能为该MFS患者的发病原因.     

两步多重PCR技术快速检测杜氏肌营养不良基因缺失

杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是男性最常见的X连锁致死性遗传病之一,临床上较轻型的BMD(Becker muscular dystrophy)是其等位基因型。DMD和BMD的发病率分别为30/10万和3/10万。三分之一的新生男婴患者由新生突变所引起。DMD基因定位于Xp~(23),是已知的最大基因,约有2300kb。由于该基因太大,用传统的限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)进行家系连锁分析,或应用cDNA探针进行Southern印迹杂交检测基因缺失均较繁琐费时,在临床上不易推广。PCR技术自1985年问世以来,已广泛应用于遗传病的基因诊断。Chamberlain等在DMD基因的两个缺失热点内,以9个易缺失外显子的旁侧顺序为引物进行多重PCR扩增,快速检测出DMD基因的绝大部分缺失型。本实验参照其多重PCR合成9对引物,并选用缺失率较高的5对引物和另外4对引物进行两步多重PCR,对中国人群中的DMD患者进行筛查,获得满意结果。     

应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率最高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.     

迟发性脊柱骨骺发育不良家系基因诊断及遗传学发病机制分析

目的 迟发性脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)是一种X-连锁隐性遗传的骨软骨发育不良疾病,主要特征包括非匀称性短躯干型身材矮小及特征性的X线片表现.目前,导致该病的已知致病基因为SEDL基因.该文的主要目的是对一个来自湖南的SEDT家系进行基因诊断和遗传学发病机制分析.方法 对一例迟发性非匀称性短躯干型身材矮小的患者进行家系分析和临床诊断;采集患者及其母亲外周血,进行DNA抽提后,对SEDL基因4个外显子的编码区进行PCR扩增;琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否存在及其大小;对未成功扩增的外显子进行长PCR扩增,并对长PCR扩增得到的截短PCR产物进行测序分析.结果 患者存在一个大小为1327bp的缺失,该缺失包括部分第5内含子和第6外显子编码区;患者母亲为该缺失的携带者.对缺失序列及其侧翼序列进行分析,发现第5内含子存在一个Alu序列,与第6外显子非编码区4个Alu序列序列高度相似;提示这些Alu序列的存在可能是SEDL基因发生类似缺失突变的遗传性发病机制的分子结构基础.结论 该文在一个湖南家系中发现的SEDL基因缺失突变,即包括第6外显子编码区在内的1 327 bp缺失,是一个新发现的国际上尚未报道的突变.对SEDL基因的突变检测有助于患者迟发性脊柱骨骺发育不良的确诊,也为女性携带者的诊断,产前诊断和遗传咨询奠定重要的前提基础.     

白化病的分子遗传学研究进展

白化病是一类罕见的遗传性疾病,具有特征性的视觉系统缺陷,表现为视力差,并伴发不同程度的色素缺失,其色素缺失可累及眼睛、皮肤和毛发[即眼皮肤白化病(OCA)]或仅累及眼睛[即眼白化病(OA)]。2013年来,白化病的分子遗传学领域取得重大进展,陆续定位了3个新的OCA位点(OCA5、OCA6和OCA7),并确定了2个OCA相关基因(C10orf11和SLC24A5)。     

大肠杆菌qseC基因敲除及其缺陷株运动能力研究

目的 通过Red同源重组法构建qseC基因缺失的大肠杆菌突变株,探讨qseC基因对大肠杆菌运动能力的影响.方法 PCR扩增两翼与目的基因上下游同源、含有氯霉素抗性基因片段,电击转化入大肠杆菌MC1000,在Red同源重组酶作用下,用含同源臂的氯霉素抗性片段置换目的 基因qseC,并利用FLP位点专一性重组将氯霉素抗性基因删除.测定qseC基因缺失株运动能力的变化.结果 qseC基因已被成功敲除.在LB培养基中,qseC基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异.MC1000与MC1000qseC基因缺失株运动圆环的直径分别为(6.10±0.36)mm和(3.20±0.53)mm(P<0.01).结论 成功构建大肠杆菌qseC基因缺失突变株,且qseC基因对细菌运动能力具有重要调控作用.     

多重荧光定量PCR方法检测X-连锁鱼鳞病家系女性携带者

目的 分析一个汉族x-连锁鱼鳞病家系中类固醇硫酸酯酶(STS)基因的致病突变,明确家系中3名女性可能携带者身份,并比较不同方法在STS基因缺失突变检测中的应用.方法 采用普通PCR方法,对家系巾男性先证者进行STS基因10个外显子的扩增,明确是否存在缺失.采用多重荧光定量聚合酶链反应(QF-Pen)方法对x-连锁鱼鳞病家系部分女性成员进行STS基因定量分析.并应用荧光原位杂交(FISH)技术进行验证.结果 普通PCR方法检测到先证者STS基因第1～10号外显子缺失;多重QF-PCR方法榆测到先证者母亲为STS基因缺失突变携带者,先证者妹妹及表妹均不存在该缺失.FISH检测结果与QF-PCR结果相同.结论 对于STS基因完全缺失型患者及女性携带者,多重QF-PCR和FISH两种方法均能有效检测,但多重QF-PCR方法对STS基因缺失的检测操作方便、自动化程度高、检测通量高.     

变性高效液相色谱检测IRS-2基因3''''-非翻译区单核苷酸多态性

目的探讨变性高效液相色谱(DHPLC)在胰岛素受体底物-2(IRS-2)基因3′-非翻译区单核苷酸多态性(SNP)检测中的应用.方法采用聚合酶链式反应(PCR),DHPLC,单链构象多态性(SSCP)和DNA序列分析对30例正常对照和30例2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区进行SNP和突变检测.结果PCR - DHPLC检测出4例PCR-SSCP分析未能发现的2型糖尿病患者IRS-2基因3′-非翻译区的SNP,并得到测序验证.结论DHPLC是一种快速、自动化程度高、操作简单、检测片段长、准确率高的SNP检测技术.它为进一步研究IRS-2基因3′-非翻译区的变异与2型糖尿病的关系奠定了基础.     

眼皮肤白化病遗传基因研究进展

白化病是一种遗传性疾病,其主要的临床表现为全身各部位色素缺乏.白化病分为3型:眼皮肤白化病(皮肤和眼部都受累及)、眼白化病(仅眼部受累及)和白化病相关综合征(存在全身性白化病的表现,又有其他系统异常).根据涉及基因的不同,眼皮肤白化病(OCA)分为4种亚型,即眼皮肤白化病Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型(OCA1-4),他们分别由酪氨酸酶(TYR)基因、p基因、酪氨酸酶相关蛋白-1(TYRP-1)基因、MATP基因的突变引起.本文分别讲述了各基因及其编码蛋白质的结构、基因突变的种类和基因的多态性.     

华东地区汉族脂肪分化相关蛋白基因SNP的研究

目的研究华东地区汉族2型糖尿病病人脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因的单核苷酸多态(SNP).方法使用PCR测序方法,对ADRP基因的启动子、外显子以及临近的内含子进行测序,确定该基因在华东地区汉族2型糖尿病病人中所存在的SNP. 结果所测ADRP基因片段总长度为5 003个碱基,有21个SNP,高频、低频分别是5、16个. 结论ADRP基因在华东地区汉族2型糖尿病病人中存在SNP;对某些SNP进行基因分型可以进一步确定ADRP基因中与2型糖尿病相关的SNP存在情况.