小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带miR-122的重组慢病毒表达载体,为研究miR-122的功能和作用机制奠定基础。方法 从小鼠基因组DNA采用PCR法扩增出pre-miR-122基因,测序后克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆转录病毒载体上,测序鉴定,病毒包装后,转染NIH3T3细胞,并通过绿色荧光蛋白进行病毒滴度测定。将重组慢病毒感染肝前体细胞（HPCs),利用实时定量PCR检测miR-122的表达。结果 重组慢病毒载体pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP经PCR扩增及测序鉴定正确,并得到了滴度为（1～5)×106 IU/mL的病毒液。pCDH-CMV-miR-122-EF1-copGFP感染的肝前体细胞中miR-122表达显著增强。结论 成功构建了小鼠miR-122重组慢病毒,并在肝前体细胞中高效表达出miR-122,为进行miR-122的功能和机理奠定了良好的基础。     

携带TPH-2基因小分子干扰RNA表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带色氨酸羟化酶(TPH)-2基因的小分子干扰RNA表达载体.方法 设计并合成shRNA TPH-2对应的两条互补的寡核苷酸链,pU6-CMV-GFP质粒经Age Ⅰ和EcoRⅠ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的 质粒转化感受态细胞,对长出的克隆应用菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析.结果 经PCR、酶切及测序证实,pU6-CMV-GFP-TPH-2 shRNA表达载体片段大小为332 bp,其中插入的片段序列和位点与预期完全一致.结论 实验成功构建pU6-CMV-GFP-TPH2 shRNA表达载体.     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

肺癌相关基因SLC35F2 RNA干扰重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的 针对肺癌相关基因SLC35F2构建RNA干扰(RNAi)重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,建立SLC35F2表达稳定抑制的H1299肺癌细胞株,并探讨SLC35F2基因的功能.方法 应用pGCSIL-PUR慢病毒载体构建针对SLC35F2的ShRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清转染肺癌细胞株H1299,经嘌呤霉素(puromycin)筛选并扩大培养得到稳定克隆;实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测癌细胞内SLC35F2的表达;CCK-8比色法检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 成功构建SLC35F2-ShRNA慢病毒载体(SLC-siRNA)及SLC35F2表达稳定抑制的肺癌细胞株,经过检测证实SLC-siRNA慢病毒载体对SLC35F2的抑制效率达81.8%;CCK-8检测显示SLC-siRNA稳定转染的H1299细胞株生长抑制率达16.3%,稳定转染株凋亡细胞百分比较阴性对照组明显升高(14.88%比3.16%,P＜0.05).结论 慢病毒载体介导的靶向SLC35F2的RNAi可有效抑制SLC35F2表达,降低肺癌细胞的增殖能力,增加其凋亡比例.

Abstract：

Objective To investigate the possibility of SLC35F2 inhibition by lentiviral vector-mediated RNA interference (RNAi) and the influence on cell proliferation and apoptosis in lung cancer cell line,and to set up a lung cancer cell line in which SLC35F2 is stably suppressed.Methods The lentiviral vector of siRNA targeted against SLC35F2 (SLC-siRNA) was constructed and transfected into the packaging cells 293T,and the viral supernatant was collected to transfect H1299 cells.After selection by puromycin and culture expansion,the stable cell clones were attained.Quantitative real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) and Western blotting were used to detect the expression of SLC35F2.The effect of SLC35F2 silencing by RNAi on cell proliferation was quantified by CCK-8 assay.Annexin V-FITC/PI staining was employed to examine the apoptosis.Results Lentiviral vector SLC35F2-shRNA was constructed successfully.As compared with control group,the SLC35F2 expression was decreased to 81.8% in RNA and protein levels.CCK-8 revealed that the inhibition rate of H1299 cells transfected with SLC35F2 was 16.3%,and the apoptosis rate was significantly increased as compared with negative control group ( 14.88% vs 3.16% ,P ＜0.05 ).Conclusion Lentiviral vector-mediated RNA interference targeting against SLC35F2 can effectively inhibit SLC35F2 expression and cell proliferation.The lung cell line in which SLC35F2 gene was stably suppressed was successfully established.     

人FoxA1基因重组慢病毒载体的构建和鉴定

【摘要】 目的 构建叉头盒蛋白A1(Forkhead-boxA1,FoxA1)的重组慢病毒表达载体,为探究其功能和作用机制奠定基础。方法〓设计基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增出FoxA1的cDNA序列,然后将其克隆至PCDH-CMV-MCS-EF1a-GFP-puro慢病毒表达载体上,经PCR、双酶切反应及DNA测序鉴定,将阳性重组FoxA1表达载体、pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91包装质粒共转染到HEK-293T细胞进行病毒包装收集病毒浓缩液,然后再感染293T细胞,通过观察绿色荧光蛋白来计算病毒滴度,最后用病毒转染原代培养人皮肤成纤维细胞(HFFs),通过实时荧光定量PCR检测FoxA1 mRNA的表达水平。结果〓重组慢病毒表达载体FoxA1经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确,并得到滴度为1×108 TU/mL的病毒液,病毒感染人皮肤成纤维细胞后表达显著增强。结论〓成功构建了人FoxA1重组慢病毒载体,并可在HFFs内高效表达,为后续FoxA1的功能和机理研究奠定了实验基础。     

靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

微小RNA let-7c慢病毒载体的构建及过表达研究

目的 构建微小RNA let-7c重组慢病毒载体,验证转染该载体系统后对肝癌细胞增殖的影响 方法 构建表达含494bp let-7c基因的重组慢病毒载体,检测let-7c及对照组病毒滴度分别为5.01×10E8 TU/m1、5.15×10E8TU/ml;转染HepG2细胞,以荧光定量聚合酶链反应(PCR)对let-7e表达水平进行检测;细胞计数试剂盒(CCK-8)试验评价let-7c过表达后对HepG2细胞增殖的影响.结果 构建的let-7c慢病毒载体经质粒酶切和测序鉴定正确;转染HepG2细胞72 h后,let-7c表达上调312倍;CCK-8法检测显示HepG2细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建Iet-7c重组慢病毒载体并感染HepG2细胞后高效表达成熟let-7c,抑制了HepG2肝癌细胞的增殖.     

Lv-shRNA-Hsa-microRNA-691慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表达载体。方法 PCR扩增pri-miR-691-2前体序列,克隆至plenti-GFP慢病毒表达载体;双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1,48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。结果酶切、测序鉴定证明插入序列正确,测定病毒滴度为1×109TU/m L,病毒感染48h后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显著增高。结论建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691的慢病毒转染系统。     

大鼠Aggrecanse-1，2特异性shRNA慢病毒表达载体的构建及测序

目的：利用RNA干扰技术，以大鼠aggrecanse-1，2基因为靶基因，设计aggrecanse-1，2基因特异性的小干扰RNA（siRNA），构建其短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒表达载体，并进行测序鉴定。方法：根据Tuschl原则设计并合成大鼠aggrecanse-1，2基因特异性的DNA寡核苷酸，连接到经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切线性化的pKCSHR-GFP质粒上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。结果：将合成的8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后，分别克隆到线性化的pKCSHR-GFP载体质粒上。在氨苄青霉素培养基条件下，筛选出相应的阳性菌落，经DNA测序鉴定确定为设计的序列。结论：成功构建了8对大鼠aggrecanse-1，2基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体，可进一步用于干扰aggrecanse-1，2基因的mRNA转录，从而为制备aggrecanse-1，2基因表达受抑制的大鼠软骨细胞奠定基础。     

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建

目的 构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV)。方法 构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定携带rAAV载体的混合细胞株BHK／SH1;再用HSV1-rc／△UI2感染、包装此细胞株并收获病毒载体rAAV-hPPE,并行DNA探针点杂交测定病毒滴度。结果 酶切鉴定pSNAV-hPPE重组成功,病毒滴度为2.5×1012v.g.／ml。结论 获得的rAAV-hPPE滴度高,感染性好,可以用于转基因镇痛的实验研究。     

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体.方法 根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列,合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的Age I酶切位点间,命名为pGC-FU-Cdh1.对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定.将293T细胞按完全随机法分为实验组(每组3只)及对照组(每组3只),分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞,倒置荧光显微镜观察后,Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况,慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定. 结果 重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断,证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中;转染293T细胞后,Western blot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1 -GFP的表达(每组3只),对照组无Cdh1-GFP的表达(n=0)(P=0.014);慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后,Reahime PCR法测定滴度为2E+8 TU/ml. 结论 成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1,并包装为慢病毒,为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础.     

携带可调控人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建四环素调控的含人前脑啡肽原基因(hPPE)逆转录病毒载体。方法用PCR方法扩增目的基因hPPE,定向克隆入逆转录病毒四环素反应质粒(pRevTRE)中,酶切反应、PCR 及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE;在脂质体介导下分别将pRevTRE/hPPE和逆转录病毒四环素调节质粒(pRevTet-on)转入包装细胞PT67,经相应的抗生素稳定筛选得到抗性细胞克隆。RT-PCR鉴定得到阳性产病毒细胞系PT67/Tet-on和PT67/TREhPPE。用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果经限制性酶切分析、RT-PCR及DNA序列分析证实pRevTRE/hPPE中含有hPPE基因。转染有pRevTet-on的FT67细胞病毒滴度为2.6×105 CFU/ml,转染有pRevTRE/hPPE的PT67细胞病毒滴度为3.2×105 CFU/ml。结论成功构建了含有受四环素调控hPPE基因的逆转录病毒载体,建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系,为可调控细胞移植镇痛的研究奠定了实验基础。     

重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建

目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.     

慢病毒载体感染人子宫内膜组织块的研究

目的在优化人子宫内膜组织块体外培养条件基础上,建立慢病毒载体感染人子宫内膜组织块的方法。方法将人子宫内膜标本剪成1 mm×1 mm×2 mm大小,移入含激素(雌二醇和醋酸甲羟孕酮)或不含激素的培养液中培养7 d,每天取3块组织块,进行大体和HE染色形态学观察。在优化的组织块体外培养条件下,组织培养液分别加入不同病毒量的慢病毒和具有促进病毒感染的感染增强液ENi.S和Polybrene,在荧光显微镜下观察荧光表达情况,比较阳性细胞率。结果人子宫内膜组织块在含激素的培养液中培养5 d后,色泽鲜红,结构完整,培养效果明显优于不含激素的培养液。3.5×10~7TU/ml病毒数量及在培养基中加入细胞增强液时,慢病毒感染阳性细胞数明显增加,阳性率达50%。结论慢病毒载体在体外可成功转染人子宫内膜组织块。     

重组前强啡肽基因35型腺病毒载体的构建

目的 构建含前强啡肽(PDP)基因的重组35型腺病毒载体(Ad5/F35).方法 以pUC57-PDP重组质粒为模板扩增PDP基因,将回收的聚合酶链反应(PCR)产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-PDP.骨架质粒pBHG-fiberS/35和穿梭质粒pDC316-PDP共转染293细胞,同源重组产生Ad5/F35-PDP.经PCR鉴定目的 基因的表达.结果 PCR表明Ad5/F35-PDP质粒构建正确.结论 获得的Ad5/F35-PDP可以用于转基因治疗的实验研究.     

小鼠胆碱乙酰基转移酶慢病毒载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的：构建胆碱乙酰基转移酶（ChAT）过表达的慢病毒载体,转染小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7,上调细胞中ChAT表达.方法：利用PCR方法从小鼠cDNA文库中调取ChAT基因,克隆至pGC-FU慢病毒载体上,经PCR和测序鉴定.用pGC-FU-ChAT质粒转染RAW264.7后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,real-time PCR检测RAW264.7细胞中ChAT基因表达丰度.结果：融合表达GFP的慢病毒载体pGC-FU-ChAT感染RAW264.7细胞的效率可达80%以上,感染细胞ChAT基因表达大幅上调.结论：成功构建了携带ChAT基因的慢病毒载体,能有效感染RAW264.7细胞,细胞中ChAT基因过表达.     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

携带VGLUT3-shRNA重组慢病毒的制备和鉴定

目的 制备携带谷氨酸转运体3( VGLUT3)基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 设计合成短发卡RNA (shRNA) VGLUT3对应的两条互补的寡核苷酸链,mU6-MCS-Ubi-EGFP质粒经Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切与退火后的寡核苷酸连接,目的质粒转化感受态细胞,对克隆的菌落行聚合酶链反应(PCR)鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序,测序正确的重组质粒转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-VGL UT3-shRNA并测定病毒滴度.结果 病毒滴度为1.5 × 109 TU/ml.结论 成功制备携带VGLUT3-shRNA的重组慢病毒.