葛根总黄酮体外诱导SHI-1细胞凋亡的分子机制

本研究旨在探讨葛根总黄酮（puerariaeradixflavoues,PRF）对人急性单核细胞白血病细胞株SHI-1凋亡的影响及其可能分子机制．以不同浓度PRF在不同时间作用于SHI-1细胞,MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2及MLL-A跖融合基因mRNA的表达,Westernblot检测MAPK、P-MAPK及NF-κB凋亡相关通路蛋白的表达,明胶酶谱法检测细胞培养上清中MMP的活性。结果表明,PRF 呈时间-剂量依赖性抑制sHI-1细胞增殖,使细胞阻滞于s期。以25、50及75μg／ml的PRF分别处理SHI-1细胞,Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9在mRNA水平呈浓度依赖性上升（P〈0．05）,Bcl-2呈浓度依赖性下降但差异无统计学意义（P〉0．05）,而融合基因MLL-AF6的mRNA与对照组相比无明显变化。将不同浓度PRF作用于SHI-1细胞,胞内JNK、P-JNK、P38MAPK及P-P38MAPK的表达均呈浓度依赖性上升（P〈0．01）;p-ERK1/2及NF-κB的表达则呈浓度依赖性下降（P〈0．01）;另细胞培养上清中MMP-2及MMP-9的活性在各处理组中基本不变。结论：一定浓度PRF可体外诱导SHI-1细胞的凋亡,具体分子机制可能与活化Caspases水解酶、激活MAPK、下调NF-κB及Bcl-2等信号分子有关,而与MLL-AF6融合基因无明显相关性。     

新型青蒿素衍生物SM1044诱导Kasumi-1细胞凋亡及机制的研究

本研究探讨新型水溶性青蒿素衍生物SM1044对人急性髓系白血病M2b细胞株Kasumi-1的诱导凋亡作用及其机制。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法观察SM1044对细胞生长的抑制作用;Annexin-Ⅴ/PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术分别检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测加药处理后Kasumi-1细胞凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP以及融合蛋白AML1-ETO的变化。结果显示:青蒿素衍生物SM1044可抑制Kasumi-1细胞的增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性;1μmol/L SM1044作用24小时,生长抑制率达到50%,48小时的IC50值为0.17±0.067μmol/L;SM1044通过Caspase依赖的途径诱导Kasumi-1细胞凋亡,细胞凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,SM1044阻滞细胞周期于G0/G1期,5μmol/LSM1044作用24小时使G0/G1期细胞由(58.33±4.46)%上升为(71.75±2.24)%;Western blot测定显示SM1044促使凋亡相关蛋白cCaspase 3(cleaved Caspase 3)、cPARP(cleaved PARP)表达水平增加,同时融合蛋白AML1-ETO表达降低。结论 :SM1044可有效抑制Kasumi-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,该过程与cCaspase 3、cPARP蛋白的表达上调有关。SM1044还能阻滞细胞周期,将Kasumi-1细胞阻滞在G0/G1期;同时SM1044能明显引起融合蛋白AML1-ETO的表达降低,可作为SM1044作用的胞内靶点。     

伊马替尼体外诱导Kasumi-1细胞增殖、分化与凋亡作用

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼诱导携带c-k it突变的细胞增殖、分化与凋亡的作用。方法应用MTT比色法观察伊马替尼对Kasum i-1细胞的生长抑制作用,流式细胞术分析细胞周期、c-k it抗原和髓系分化抗原CD11b、CD13和CD15的表达,AnnexinⅤ标记和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡,应用W estern b lot方法分析Kasum i-1细胞c-k it蛋白酪氨酸磷酸化水平。结果伊马替尼呈时间和剂量依赖性抑制Kasum i-1细胞生长,72 h半数抑制浓度(IC50)为4.45μmol/L;伊马替尼5.00μmol/L使Kasum i-1细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞减少;髓系分化抗原CD11b、CD13和CD15表达增加;作用24 h,早期凋亡细胞比例由9.04%升至86.84%(P<0.05),培养第5天出现明显DNA梯形条带;作用72 h,Kasum i-1细胞中c-k it蛋白酪氨酸磷酸化水平下降。结论酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼能够抑制携带c-k it突变的细胞的生长,诱导细胞分化和凋亡。     

热休克蛋白90抑制剂诱导Kasumi-1细胞凋亡和分化的机制探讨

目的探讨热休克蛋白90（HSP 90）抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素（17AAG）诱导白血病细胞生长抑制、分化和凋亡作用.方法应用MTT比色法观察17AAG对白血病细胞系Kasumi-1细胞的生长抑制作用,用流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达,用Annexin V标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测干细胞因子受体（KIT）蛋白水平,RT-PCR测定c-kit mRNA水平.结果17AAG明显抑制Kasumi-l细胞的生长,半数抑制浓度（IC50）为0.62 μmol/L;17AAG诱导Kasumi-1细胞凋亡呈时间、剂量依赖性,17AAG处理24 h早期凋亡细胞增加,48 h晚期凋亡细胞增加,早期凋亡细胞减少.17AAG可诱导Kasumi-1细胞髓系分化抗原CD11b及CD15表达增加,并呈剂量和时间依赖性.经17AAG作用后细胞阻滞于G0/G1期,伴有S期细胞减少.Western blot检测发现17AAG可降低KIT水平,处理2 h开始减少,处理20 h后KIT基本消失,但c-kit mRNA水平并未受影响.结论HSP 90抑制剂17AAG通过降解KIT蛋白抑制Kasumi-1细胞生长,使细胞阻滞于G0/G1期,诱导其发生凋亡及部分分化.     

葛根总黄酮诱导人早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡的实验研究

本研究探讨葛根有效成分对恶性白血病可能的凋亡诱导作用及其分子机制。采用葛根总黄酮(flavonoids of puerarin,PR)处理人早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4,用MTT法检测细胞增殖抑制率;FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;实时定量PCR检测pml/rarα、bcl-2、survivin基因表达;Western blot检测JNK、p38MAPK、FasL及caspase相关酶的变化。结果发现,PR能明显抑制NB4细胞增殖,并诱导细胞凋亡。随着PR浓度的增加,pml/rarα、bcl-2及survivin基因在mRNA水平表达下调,JNK、FasL、caspase3及caspase8蛋白表达增加,与PR浓度呈正相关;PR联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)处理后上述作用更为明显。结论:PR诱导NB4细胞凋亡的机制可能与JNK相关信号分子的活化有关;PR联合ATO具有协同诱导NB4细胞凋亡的作用。     

AML1-ETO融合蛋白致细胞转化的分子机制

急性髓系白血病(AML)-M2b通过其特征性染色体易位t(8;21)而致AML1-ETO融合蛋白,该融合蛋白主要通过抑制AML1靶基因的活化致细胞转化,它除竞争性地抑制AML1靶基因的活化外,还通过募集核共抑制复合物主动地抑制AML1靶基因的基础转录。此外,它还通过蛋白-蛋白相互作用影响非AML-1靶基因的功能,干扰细胞正常的增殖与分化而致细胞转化。AML-1-ETO融合蛋白的转化潜力是有限的,白血病的发病除了它外尚需其它基因突变事件的参与。     

RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用

目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.     

丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用

本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（HDAC）丙戊酸钠（VPA）逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用。Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT—PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclinD2mRNA水平的变化情况。结果表明：不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1—3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。以3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3mmol／LVPA组cyclinD2mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。结论：VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AMLl／ETO融合蛋白的转录抑制并增加aml-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2 mRNA的表达。     

环腺苷酸拟似物8-CPT-cAMP诱导M2b型急性髓系白血病细胞系Kasumi-1细胞分化的研究

为了解环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸（8-CPT-cAMP）对M2b型急性髓系白血病（AML-M2b）细胞的作用,以AML-M2b细胞株Kasumi-1细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、表面分化抗原、细胞周期分布以及对四氮唑蓝的还原能力的改变,研究8-CPT-cAMP对Kasumi-1细胞增殖及分化的影响,并应用半定量RT-PCR和Western blot检测药物处理前后Kasumi-1细胞内AML1-ETO融合蛋白的变化。结果发现,8-CPT-cAMP（200μmol/L）可明显抑制Kasumi-1细胞增殖而促使细胞趋向分化,但这种分化不是典型的完全终末性分化,8-CPT-cAMP对Kasu-mi-1细胞内AML1-ETO融合基因及其编码蛋白的表达无显著影响。结论：8-CPT-cAMP对AML-M2b细胞具有诱导分化效应。     

脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠体外诱导Kasumi-1细胞分化和凋亡作用

目的 探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)体外阻断AML1-ETO的生物学功能，消除AML1-ETO的转录抑制，诱导Kasumi-1细胞生长抑制、分化和凋亡作用。方法 应用MTT比色法观察PB对细胞的生长抑制作用，普通光学显微镜和透射电镜观察细胞形态和结构改变，流式细胞术分析细胞周期和检测髓系分化抗原的表达，Annexin V标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡。结果 ①PB明显抑制Kasumi—1细胞的生长，半数抑制浓度(IC50)约为2．3mmol/L；②经PB作用后细胞阻滞于G0／G1期，伴有S期细胞减少；③PB可诱导Kasumi—1细胞髓系分化抗原CD11b和CD13表达增加，并呈剂量和时间依赖性；④PB诱导Kasumi-1细胞凋亡，呈时间剂量依赖性，PB3mmol/L培养2d早期凋亡细胞增加，培养3d晚期凋亡细胞增加，培养5d出现明显DNA梯形条带；⑤处理后的细胞出现单核细胞样分化和凋亡细胞形态改变。结论 脱乙酰化酶抑制剂PB抑制Kasumi—1细胞生长，使细胞阻滞于G0／Gl期；诱导细胞部分分化和凋亡。     

地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制研究

目的:探讨地西他滨对白血病Kasumi-1细胞的毒性作用及其机制。方法:应用CCK-8法检测0.5～100μmol/L地西他滨作用Kasumi-1细胞24、48、72 h后的细胞存活率,An-nexinⅤ-FITC/PI双染色法检测0.5～20μmol/L地西他滨处理Kasumi-1细胞48 h后的细胞凋亡率,流式细胞碘化丙啶单染色法观察G0/G1期、S期、G2/M期Kasumi-1细胞比例;逆转录PCR法检测p21WAF1/CIP1基因表达水平的变化。结果:0.5～100μmol/L地西他滨均可抑制Kasumi-1细胞增殖,并呈现剂量依赖性与时间依赖性,作用24、48、72 h的IC50浓度分别为6.92、5.03、4.47μmol/L;0.5～20μmol/L地西他滨诱导Kasumi-1细胞凋亡水平较低,但能以剂量依赖的方式阻滞Kasumi-1细胞G2/M期,上调p21WAF1/CIP1基因表达。结论:地西他滨对Kasumi-1细胞具有毒性作用,其机制可能与上调p21WAF1/CIP1表达以及阻滞细胞周期有关。     

AML1-ETO9a异构体在伴t(8；21)M2型急性髓系白血病中表达比例的监测及其意义

目的 研究AML1-ETO9a (AE9a)异构体在伴有t(8;21)的M2型急性髓系白血病( AML-M2)患者中表达比例的变化及其临床意义.方法 应用RT-PCR方法筛选了44例初诊AE9a与AML1-ETO(AE)融合基因共表达的伴有t(8;21)的AML-M2患者.应用实时定量PCR技术监测这44例多次随访标本中AE9a在AE9a与AE两者总和中百分比的变化.结果 伴有t(8;21)的44例初诊AML-M2患者中AE表达量高于AE9a(中位CT值分别为20.48和21.54),两者表达量呈正相关(r =0.900);44例初诊患者经首次标准方案化疗后AE与AE9a表达量均下降,但初治后AE9a在总体中百分比较初诊时上升(P＜0.05);患者经1个疗程标准方案化疗后,未达完全缓解(CR)组的AE9a百分比明显高于CR组(中位值分别为36.81％和7.93％,P＜0.05);复发患者缓解期间AE9a百分比高于未复发患者(中位值分别为22.89％和2.43％,P＜0.05);缓解期间,17例复发患者中11例AE9a百分比在AE表达低水平时即出现升高甚至异常升高.结论 AE9a与AE共表达于伴有t(8;21)的AML-M2患者中,并且AE表达量高于AE9a,两者呈正相关.AE9a异构体对标准化疗的敏感性较AE差.在缓解期监测AE9a在AE及AE9a两者总体中百分比的变化比单独监测AE融合基因能更早地预示疾病复发趋势,从而可提前进行临床干预,降低患者的复发率,提高患者的长期生存率.     

丙戊酸钠对Kasumi-1细胞细胞周期的阻滞作用及其机制探讨

目的 研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸钠(VPA)对白血病细胞系Kasnmi-1细胞周期的影响并探讨其分子机制.方法 不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞不同时间,碘化丙锭染色流式细胞术分析细胞周期的变化.RT-PCR及Western blot方法 分析细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21 WAF1/CIP mRNA或蛋白水平变化.结果 ①VPA抑制Kasumi-1细胞的细胞周期,使其阻滞于G0/G1期.3 mmol/L VPA处理3 d,G0/G1期细胞由(50.7±2.8)%上升至(80.7±1.7)%.②以3 mmol/LVPA处理Kasumi-1细胞不同时间,与对照组比较,3 mmol/L VPA组cyclin D1 mRNA表达水平下调;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3 d,结果 发现随着VPA药物浓度增加cyclin D1 mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性.③VPA诱导p21WAF1/CIP mRNA表达明显增加,呈现时间及剂量依赖性.不同浓度VPA处理细胞3 d时,随着用药浓度的增加,p21WF1/CIP蛋白相对表达水平增加,3 mmol/L VPA处理细胞2 d与0 d比较,p21 WAF1/CIP蛋白相对表达水平明显增加(2.498±0.240对0).结论 VPA可以通过对cyclin D1及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21WAF1/CIP调节使Kasumi-1细胞周期阻滞于G0/G1期.     

AML1-ETO对p21 WAF1/CIP1启动子转录活性作用的研究

目的观察AML1-ETO融合基因对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的影响，探讨AML1-ETO促进白血病发生的机制。方法构建p21WAF1／CIP1基因启动子的报告质粒，与AML1-ETO、AML1b和AML1a的表达质粒共转染非洲绿猴肾细胞系CV—1细胞，测定荧光素酶的活性，分析AML1-ETO、AML1b和AML1a对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的影响。结果在CV—1细胞中，AML1-ETO对p21WAF1／CIP1基因启动子的转录具有明显的抑制作用，在pCMV5-AML1-ETO的剂量为1000ng时，p21WAF1／CIP1启动子的转录活性下降为对照组的（19±4）％，这种作用具有序列特异性和剂量依赖性；AML1b和AML1a对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的抑制作用不明显，在剂量为1000ng时，p21WAF1／CIP1启动子的转录活性分别下降为对照组的（61±16）％和（594-16）％。结论AML1在与ETO形成融合基因后，其产物由于ETO蛋白能够更有效地募集转录共抑制复合物，其转录抑制活性要比AML1a和AML1b更强；外源的AML1-ETO对p21WAF1／CIP1的作用可能也与细胞系有关。     

AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a pcDNA3. 1 -AML1-ETO expression vector and investigate its effects on proliferation and differentiation of U937 leukemic cells. Methods AML1 -ETO gene was amplified by PCR from pCMV5-AML1-ETO and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/V5-His-TOPO. The recombinant plasmid was transfected into U937 cells by Lipofectamin 2000. Individual clones selected with G418 were isolated. The integration and the expression levels of AML1-ETO in transfectants were determined by PCR, RT-PCR and Western blot analysis respectively. Trypan blue refusal staining method was used to detect the proliferation of U937 cells. Light microscope was applied to observe the morphologic changes of the cell. The expression of myeloid cell differentiation antigen was detected using flow cytometry. Results The recombinant pcDNA3. 1-AML1-ETO was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The highly expressing AML1-ETO subclone was established. AML1-ETO was expressed in U937 cells transfected with pcDNA3.1 -AML1-ETO. The growth of the monoclonal cells was inhibited evidently (P < 0. 05). The expression of CD11b in transfected group [(4. 17±0. 31)%] was lower than that in empty plasmid transfected group and non-transfected group [(11.40 ± 0. 17)% and (11.03 ± 0. 15) %] respectively (P < 0.001). Transfected cells displayed morphology of less differentiation. The expression level of CD11b was unchanged in transfected cells treated with TPA (P > 0. 05). Conclusion The eukaryotic expression vector for AML1ETO gene was successfully constructed and expressed in U937. AML1-ETO inhibits the proliferation and differentiation of transfected cells. It provides the basis for further study of mechanisms of AML1 -ETO in leukemogenesis.     

磷肌酰脂醇特异性磷脂酶C对内毒素介导枯否细胞激活的抑制作用

目的 研究磷肌酰脂醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）对内毒素介导的肝Kupffer细胞（枯否细胞，KCs）激活及其CDl4表达的抑制作用。方法 Wistar大鼠20只，分为PI-PLC组和LPS组，测定细胞培养液中TNF-α和IL-6含量变化，用免疫组化观察KCs膜CD14和核NF-κB的相对活性，测定KCs中CD14、TNF-α和IL-6的mRNA表达和KCs膜CD14蛋白含量变化。结果 不同浓度的LPS刺激60min后，PI-PLC组培养液中TNF-α与IL-6的含量随LPS浓度的增高而增加，但明显低于LPS组（P〈0．01）；CD14抗体染色显示，PI-PLC组部分KCs为弱阳性，而LPS组KCs为阳性细胞；NF-κB P65抗体染色显示，PI-PLC组部分KCs为弱阳性细胞，而LPS组KCs为强阳性细胞；PI-PLC组NF-κB活性在10μg／mL以上LPS刺激下才有升高，其相对光密度值显著低于LPS组（P〈0．01）；在相同浓度LPS刺激后，PI-PLC组CD14、TNF-α和IL-6的mRNA表达显著低于LPS组（P〈0．01）；PI-PLC组在相同浓度LPS刺激120min后CD14蛋白表达才明显，LPS组在100μg／mL LPS刺激后30min CD14蛋白开始升高，两者有显著性差异（P〈0．01）。结论 PI-PLC对LPS介导的KCs激活有明显的抑制作用，其机制可能与抑制KCs中CD14蛋白的表达有关。