羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制

背景研究表明,羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡,但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性,并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库,采用组织块培养法培养和传代HTFs,采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板,分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1,终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h,用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组,药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白,采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形,波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后,随着药物质量浓度的增加,对HTFs增生的抑制率增加,差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34,P=0．00;VP-16：F=62．60,P=0．00;HCPT＋VP-16：F=46．77,P=0．00）,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L,HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399,表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％,差异有统计学意义（F=18．23,P〈0．01）,其中HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs凋亡率较空白对照组明显升高,差异均有统计学意义（q’=15．67、16．32、26．88,P〈0．01）。Westernblot法检测结果表明,与空白对照组相比,HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中活化型easpase．3、bax、p-JNK表达的灰度值明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,且HCPT＋VP-16处理组HTFs中上述各因子表达的灰度值较HCPT处理组、VP-16处理组明显增加,差异均有统计学意义（P〈0．01）,而easpase-3、JNK、Akt的表达无明显变化。与空白对照组比较,bcl-2、p-Akt在HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中的表达量明显下降,HCPT＋VP-16处理组较HCPT处理组、VP-16处理组的表达量明显减少,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论单独使用HCPT、VP-16均能诱导体外培养的HTFs凋亡,其作用均呈剂量依赖性,HCPT与VP-16联合应用有强协同作用。HTFs中p-JNK、bax的表达上调和p-Akt、bcl-2表达的下调参与联合用药引起的协同效应。     

氯化锂对人Tenon囊成纤维细胞增生抑制作用的机制研究

目的:探讨氯化锂对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)缝隙连接细胞间通讯(GJIC)的影响及其可能的作用机制。方法:收集2019年4月于德州市人民医院眼科行斜视手术的1例患者的Tenon囊组织,剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养并传代,取第4代HTFs进行实验。将HTFs分为对照组和氯化锂处理组,对...     

羟基喜树碱对青光眼滤过术后球结膜下成纤维细胞凋亡的影响及其机制研究

【摘要】 目的 观察羟基喜树碱（hydroxycamptothecin,HCPT）对青光眼滤过术失败的球结膜下瘢痕组织成纤维细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。设计 实验研究。研究对象 球结膜下瘢痕组织成纤维细胞。方法 体外培养青光眼滤过手术失败的球结膜下瘢痕组织成纤维细胞并鉴定。应用不同浓度的HCPT作用于成纤维细胞。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用RT-PCR方法检测HCPT作用下,有或无广谱caspase阻断剂（Z-VAD-FMK）时,凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA量的变化。主要指标 凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA量的变化。结果 流式细胞检测显示,0.06、0.25、1.0、4.0 mg/l的HCPT作用于成纤维细胞24小时后,其凋亡率分别为0.87%、4.97%、5.76%、33.1%（P<0.05）。RT-PCR法显示,HCPT作用时caspase-3和caspase-9 mRNA的量较空白组明显增多,而caspase-8 mRNA的量较空白组减少;加入Z-VAD-FMK后,caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA的量均减少。结论 HCPT在体外可诱导青光眼滤过手术球结膜下瘢痕组织成纤维细胞发生凋亡,且具有浓度依赖性,该凋亡可能通过caspase-3和caspase-9途径来实现。（眼科,2012,21：273-277）     

羟基喜树碱对人眼Tenon蒺s囊成纤维细胞的抑制作用

目的：研究羟基喜树碱（HCPT）对人眼Tenon＇s囊成纤维细胞（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTFs）的细胞周期、细胞毒性的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法：取本院眼库新鲜眼球（〈6h）的Tenon＇s囊组织,用组织块培养法进行成纤维细胞体外培养;流式细胞仪测定HCPT和丝裂霉素C（MMC）对HTFs细胞周期的影响;台盼蓝染色法鉴定HCPT和MMC对HTFs的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起;RT-PCR检测HCPT、MMC作用24h后HTFs的Smad7 mRNA基因表达。结果：HTFs体外生长良好,可用于实验研究。不同浓度HCPT（0,0.25,1,4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G2期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;不同浓度MMC（0,0.025,0.1,0.4mg/L）作用后的HTFs细胞周期与对照组相比,G1期细胞百分数的组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。不同浓度HCPT和MMC作用后的HTFs活细胞率和空白对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。4mg/LHCPT,0.4mg/LMMC作用HTFs24h后,Smad7 mRNA表达水平与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：HCPT将HTFs阻滞于G2期,MMC将HTFs阻滞于G1期;HCPT,MMC抑制HTFs的作用和药物的细胞毒性无关;HCPT抑制HTFs的增殖可能是通过上调Smad7mRNA的表达阻断TGF-茁信号通路实现的。     

Bevacizumab对人Tenon囊成纤维细胞转分化的抑制作用

目的　观察Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（贝伐单抗）对转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ,ＴＧＦ）-β２诱导下的人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞转分化的抑制作用,探讨抗新生血管药物抑制青光眼术后滤过泡瘢痕化的机制。方法　用含体积分数１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ高糖型培养基对人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞株进行体外常规培养和传代。实验分为空白对照组、ＴＧＦ-β２处理组（加入终浓度为１０μｇ?Ｌ－１的ＴＧＦ-β２ＤＭＥＭ完全培养基）及Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ干预组（加入１０μｇ?Ｌ－１的ＴＧＦ-β２和１．０ｇ?Ｌ－１的ＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂＤＭＥＭ完全培养基）,置于３７℃、体积分数５％二氧化碳培养箱中培养４８ｈ,并分别应用细胞免疫荧光染色技术和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验检测Ｂｅｖ-ａｃｉｚｕｍａｂ对ＴＧＦ-β２刺激下人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｃｔｉｎ,α-ＳＭＡ）表达的影响。结果　α-ＳＭＡ蛋白主要表达在细胞质中,免疫荧光染色结果显示ＴＧＦ-β２处理组可以见到α-ＳＭＡ的荧光表达,而Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ干预组α-ＳＭＡ蛋白表达受到抑制。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果显示空白对照组、ＴＧＦ-β２ 处理组及Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ干预组α-ＳＭＡ蛋白相对表达量分别为０．６３０±０．０３８、１．１３０±０．０７１和０．３４０±０．０３３,Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ干预组α-ＳＭＡ蛋白相对表达量低于空白对照组和ＴＧＦ-β２处理组（均为Ｐ＜０．０５）。结论　Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ可明显抑制ＴＧＦ-β２诱导下人Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞α-ＳＭＡ蛋白的表达,抑制成纤维细胞表型转化。     

汉防己甲素诱导人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的 研究汉防己甲素(Tet)抑制人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)的凋亡效应.方法 用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定.通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用.结果 人眼TCFs体外生长良好.透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G_0/G_1期细胞减少22.2%,S期细胞增加20.53%,G_2/M期细胞增加1.6%,Tet抑制TCFs细胞周期于G1期,Tet组凋亡率明显高于对照组(P=0.000).结论 Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用.     

兔眼Tenon囊成纤维细胞体外培养方法的研究

探索体外培养兔眼Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的简便方法。把兔结膜和结膜下组织剪碎后直接接种在培养瓶中,加入ＤＭＥＭ培养液进行培养,省略胰蛋白酶消化过程或者组织块干固贴壁过程。此方法简单而且有效。本文对此进行了详细的介绍,同时还介绍了如何分离培养时混杂生长的结膜上皮细胞,并且对体外培养的兔Ｔｅｎｏｎ囊成纤维细胞的生长速度进行了研究。     

CCK-8检测法研究槲皮素对人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的 观察槲皮素（quercetin,QU）对体外培养的（human Tenon＇s capsule fibroblasts,HTCF）增殖的抑制作用.方法 体外培养HTCF.配制QU溶液,其浓度依次为20 μmol·L^-140 μmol·L^-160 μmol·L^-180 μmol·L^-1100 μmol·L^-1用活细胞计数试剂盒CCK-8检测不同浓度QU作用下HTCF的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化.结果 不同药物浓度HTCF形态学检测显示：50 μmol·L^-1U作用48 h后,细胞收缩,胞核固缩,聚集在核膜边缘;100 μmol·L^-1U作用48 h后,细胞未见增殖,出现凋亡小体,细胞的增殖几乎完全被抑制.细胞生长抑制实验的结果显示：QU在各浓度组对体外培养的HTCF均有抑制作用,抑制效应呈剂量时间依赖关系.结论 QU能抑制体外培养的HTCF的增殖,且该作用呈剂量和时间依赖性.     

HCPT联合Ver诱导兔结膜成纤维细胞的凋亡实验研究

目的　观察羟基喜树碱 (hydroxycam ptothecin,H CPT)、维拉帕米 (verapam il,Ver)单独或联合应用诱导兔体外培养成纤维细胞 (fibroblast ,FB)凋亡的作用。方法　采用兔结膜 FB体外原代培养及 TU NEL染色法观察 HCPT单独或联合 Ver应用时 ,对兔结膜 FB凋亡指数 (apoptotic index,A I)、形态的影响 ,并进行相关统计学分析。结果　 H CPT 1m g· L- 1作用 12 h后 ,细胞开始出现凋亡的形态学改变 ,5～ 3 0 m g· L - 1的 HCPT诱导 FB的 A I高峰均出现在作用后 72 h左右 ,且随着浓度增加 ,凋亡细胞数增多。5m g· L- 1H CPT联合 5m g· L- 1Ver诱导 FB的 A I(48h为 2 4 .5± 3 .4 )于 12～ 4 8h略低于 10 m g· L- 1组 H CPT的 A I (48h为 2 4 .6± 3 .9) ,当作用时间达 72 h时 ,则前者的 A I (3 0 .4± 3 .4 )大于后者的 AI (2 5.2± 5.6) (χ2 =6.74 ,P<0 .0 1)。结论　 H CPT可诱导兔 FB凋亡 ,当联合 V er应用时 ,诱导凋亡作用增强。     

结缔组织生长因子对POAG患者Tenon囊成纤维细胞的影响

目的：研究结缔组织生长因子(CTGF)对原发性开角型青光眼(POAG)患者Tenon囊成纤维细胞(Tfb)增殖、移行和转化的影响。

方法：POAG患者的Tenon囊组织行组织块法培养出来的Tfb细胞分为2组：(1)对照组;(2)CTGF处理组：DMEM-F12培养液中分别加入终浓度为1.0、10.0、100.0ng/mL的CTGF。细胞处理24h后,分别用MTT法和细胞划痕法分别检测Tfb的增殖和移行,半定量RT-PCR法和免疫组织化学法分别检测Tfb中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平的变化和蛋白的表达。

结果：MTT法测得1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组的A值分别是0.436±0.009、0.643±0.009、0.679±0.006,对照组为0.423±0.156。细胞划痕法显示,细胞移行数分别为34.600±3.507、70.400±2.074、80.000±2.915个,对照组为31.000±3.536个。RT-PCR法得出不同浓度CTGF处理组α-SMA/β-actin条带吸光度比值分别为0.873±0.161、1.213±0.312、1.352±0.376,对照组是0.851±0.158。免疫组织化学法得出1.0、10.0、100.0ng/mL CTGF处理组阳性细胞的平均光密度值分别是0.110±0.026、0.141±0.017、0.175±0.027,对照组是0.108±0.020。上述所有观察指标10.0、100.0ng/mL CTGF组与对照组相比较均有差异(P<0.05),而1.0ng/mL CTGF与对照组相比较均无差异(P>0.05)。

结论：CTGF能促进POAG患者Tfb的增殖、移行和表型转化,CTGF可能在滤过泡瘢痕化中扮演了重要作用。     

紫杉醇对人Tenon囊成纤维细胞增生的抑制作用及机制

背景人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的异常增生是导致抗青光眼滤过手术失败的主要原因。寻找抑制HTFs增生的药物对抑制青光眼术后功能性滤过泡的瘢痕化有重要意义。目的观察紫杉醇对体外培养的HTFs增生、凋亡、细胞周期以及基质金属蛋白酶-1（MMP-1）表达的影响。方法收集抗青光眼滤过术中切除的人眼Tenon囊组织,用组织块培养法培养HTFs并进行传代,取3～6代细胞用于实验。采用小鼠抗人角蛋白抗体、小鼠抗人波形蛋白抗体、小鼠抗人结蛋白抗体、小鼠抗人S-100抗体行免疫组织化学染色鉴定培养的HTFs。在培养基中分别加入0、1×10^-8、1×10^-8、1×10^-6mol／L紫杉醇,采用实时细胞电子分析系统（RT—CES）观察不同浓度紫杉醇作用后HTFs的细胞指数变化;采用DAPI染色法观察各组细胞的凋亡情况;用流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用后HTFs各细胞周期比例;采用实时定量PCR（real—timePCR）和ELISA法检测各组HTFs中MMP-1mRNA和蛋白的表达量,分别以MMP-1mRNA／GAPDHmRNA和MMP-1蛋白质量浓度（μg／L）表示。结果组织块原代培养7d内可见细胞游出,呈长梭形和不规则三角形,培养的细胞抗波形蛋白抗体染色阳性,而抗角蛋白抗体、抗结蛋白抗体和抗S-100抗体染色阴性。培养基中加入紫杉醇作用24h后,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇组平均细胞指数值分别为1．09±0．191、0．665±0．093和0．473±0．117,均明显低于0mol／L紫杉醇组的1．514±0．283,差异均有统计学意义（均P=0．000）;紫杉醇作用后,HTFs的细胞核内可见呈DAPI蓝色荧光的颗粒状物质,荧光强度随着紫杉醇浓度的增加而增强。l×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇分别作用12h后,G,／M期HTFs的比例分别为（9．20±0．80）％、（12．37±0．45）％和（13．80±0．35）％,明显高于0mol／L紫杉醇组的（7．17±0．50）％,差异均有统计学意义（P=0．005、0．000、0．000）。与0mol／L紫杉醇组比较,1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用30min后HTFs中MMP-1mRNA的相对表达量均明显下降,差异均有统计学意义（均P=0．000）;1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6mol／L紫杉醇作用24h后,HTFs中MMP-1蛋白的表达量均明显低于0mol／L紫杉醇组,差异均有统计学意义（P=0．010、0．002、0．001）。结论1×10^-8～1×10^-6mol／L紫杉醇可抑制体外培养HTFs的增生,诱导细胞凋亡,阻断细胞的有丝分裂,其作用机制可能与下调细胞中MMP-1的表达有关。     

曲古抑菌素A对人Tenon囊成纤维细胞作用的研究

目的：研究曲古抑菌素A( trichostatin A,TSA)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞( human Tenon capsule fibroblast, HTF)增殖能力以及组蛋白去乙酰化酶1( histone deacetylase 1,HDAC1)和HDAC2蛋白表达的影响。
　　方法：取青光眼滤过术中Tenon囊组织进行HTF体外培养。选取第3~6代细胞进行实验。设置空白对照组及TSA组(600nmol/L TSA加入培养液中),分别于培养后1,2,3 d应用 MTT法检测细胞活力变化;以600 nmol/L TSA处理 HTF 2 d 后, Western blot 法检测细胞中 HDAC1和HDAC2蛋白的表达。
　　结果：与对照组比较,TSA作用1d后HTF活力下降,呈时间依赖性,具有统计学差异( P<0.05)。 TSA处理HTF后2d,Western blot法检测HDAC1和HDAC2蛋白表达受到明显抑制。
　　结论：TSA可以通过抑制HDAC1和HDAC2的表达量,抑制人Tenon囊成纤维细胞增殖,从而减少术后结膜瘢痕形成可能。     

抗青光眼术后滤过泡瘢痕化组织人Tenon囊成纤维细胞的生长特性

背景 抗青光眼滤过术后瘢痕组织中的主要细胞成分是人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）,探讨滤过泡瘢痕组织中HTFs的生长特性可为抗青光眼滤过术后预防瘢痕形成的研究提供实验基础. 目的 研究抗青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化组织中HTFs的体外生长特性. 方法 收集因抗青光眼小梁切除术后滤过泡瘢痕化行二次手术的患者8例8眼的Tenon囊组织（4 mm＆#215;5 mm）,同期以同样的取材方法收集行斜视矫正术患者8例8眼的正常Tenon囊组织.采用组织块贴壁法将Tenon囊组织进行原代培养,用鼠抗人波形蛋白细胞免疫荧光法鉴定培养的HTFs,并用巢式PCR法检测培养的HTFs中是否受到支原体的污染.分别于第0、4、7、11、14天以发光法细胞活力检测HTFs,并绘制各组细胞的生长曲线,计算细胞群体倍增时间（PDT）.比较瘢痕组和正常组HTFs形态学和PDT的差异;将瘢痕组第5代与第15代HTFs的形态及PDT进行比较,评价细胞传代生长特性的稳定性. 结果 HTFs原代培养1～2周达到融合,呈长梭形,形态符合HTFs,传代细胞4～6 d达到融合.瘢痕组与正常组HTFs的生长特性相近,对鼠抗人波形蛋白抗体呈阳性反应,PCR检测未见支原体反应条带.瘢痕组和正常组HTFs的PDT分别为（20.54±3.51）h和（18.86±2.91）h,差异无统计学意义（t=0.634,P=0.561）.细胞培养后第4、7、11和14天,瘢痕组HTFs的细胞数与正常组比较差异均无统计学意义（t=2.663,P=0.081;t=0.194,P=0.863;t=3.338,P=0.053;t=0.627,P=0.565）,2个组的HTFs随培养时间的延长显示出一致的增生曲线.瘢痕组第5代和第15代细胞PDT分别为（20.54±3.51）h及（22.84±4.15）h,差异无统计学意义（t=0.733,P=0.505）;第5代与第15代间细胞生长曲线可见其增生能力均稳定,两代间HTFs在各时间点的细胞数差异均无统计学意义（t=1.528,P=0.235;t=0.269,P=0.786;t=1.954,P=0.139;t=0.730,P=0.506）.结论 抗青光眼术后滤过泡瘢痕化患者的HTFs体外培养生长状态良好,增生能力稳定,是进行青光眼术后滤过区抗纤维化研究的良好靶细胞.     

光动力疗法抑制体外培养的人球筋膜囊成纤维细胞增殖的研究

目的　探讨光动力疗法 (photodynamictherapy ,PDT)对体外培养的人球筋膜囊成纤维细胞增殖的抑制作用。方法　将体外培养的人球筋膜囊成纤维细胞分成A至J组 ,每组 4孔。其中A至G组为PDT组 ,依次加入光敏剂苯并卟啉衍生物单环酸A ,使其终浓度分别为 2 5 0× 10 3g/L、1 2 5× 10 3g/L、0 6 2× 10 3g/L、0 31× 10 3g/L、0 16× 10 3g/L、0 0 8× 10 3g/L及 0 0 4× 10 3g/L ,15min后用波长为 6 89nm ,能量密度为 2 40J/cm2 的半导体激光照射。H组为丝裂霉素C(mitomycinC ,MMC)对照组 ,加入MMC使其终浓度为 0 2 0g/L。I组为空白对照组 ,未加任何处理。J组为单纯激光对照组。各组培养 2 4h后 ,用四唑盐比色试验法测量各孔在 490nm处的吸光度 (A值 ) ,并计算每组成纤维细胞抑制率。结果　PDT治疗后A至H组A值分别与I组A值比较 ,差异均有显著意义 (A至H组P值均为 0 0 0 0 ) ;J组与I组差异无显著意义 (P =0 2 0 3) ;A至G组的成纤维细胞抑制率分别为 93 3%、91 0 %、90 3 %、87 1%、6 6 0 %、41 6 %、12 5 %;H组的成纤维细胞抑制率为 93 0 %。结论　PDT对体外培养的人球筋膜囊成纤维细胞增殖有抑制作用 ,且抑制作用的大小随光敏剂浓度的增加而增强。     

人眼Tenon's囊成纤维细胞原代培养的研究

目的探讨体外培养原代人眼Tenon’s囊成纤维细胞的方法及其生长特性,为抗纤维化研究提供靶细胞模型。方法取翼状胬肉及斜视手术患者的Tenon’s囊组织,用组织块法培养原代成纤维细胞。用免疫荧光方法鉴定细胞。对细胞进行传代、冻存和复苏的观察。对复苏后的细胞行MTT法检测其活力并绘制生长曲线。结果人眼Tenon’s囊成纤维细胞可以在体外用组织块方法培养出来,呈典型的长梭形。免疫荧光鉴定细胞波形蛋白染色阳性。细胞多次传代后依然生长迅速,3 d即可长满瓶底。复苏后细胞2~6 d处生长对数期,增殖能力良好。结论人眼Tenon’s囊成纤维细胞体外生长状态良好,可以液氮冻存,复苏后细胞活力较强,可以用于抗纤维化增生的基础研究。     

阿昔洛韦对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖迁移的影响

目的:探索阿昔洛韦(ACV)对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增殖和凋亡的影响以及作用机制。方法:将HTFs分为ACV处理组和空白组;CCK8检测不同浓度梯度下的细胞增殖速率,划痕实验检测HTFs迁移能力,流式细胞术检测HTFs凋亡以及细胞周期。结果:与空白组相比,ACV处理组(终浓度分别为1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L)HTFs增殖速率显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性。4.5mmol/L ACV处理组划痕细胞迁移率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P=0.0005),细胞周期G0/G1期峰值升高(P=0.0011),S期下降(P=0.0006),细胞周期被阻滞在G0/G1期。结论:阿昔洛韦可以通过阻滞HTFs周期促进细胞凋亡,抑制HTFs的增殖和迁移。     

结缔组织生长因子对人Tenon囊成纤维细胞中E-cadherin蛋白表达的促进作用

背景 青光眼滤过手术后滤过通道的瘢痕化是手术失败的主要原因,其主要病理机制是成纤维细胞的异常增生、间质-上皮转分化及细胞外基质的重塑.结缔组织生长因子(CTGF)是促进瘢痕形成的关键因子,而CTGF是否能促进人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的间质-上皮转分化尚不清楚.目的 观察CTGF对HTFs间质-上皮转分化的影响.方法 用体积分数10％胎牛血清的DMEM高糖型培养液进行HTFs体外常规培养和传代,取3～6代细胞用于实验.将培养的HTFs分为空白对照组和CTGF处理组,空白对照组用DMEM完全培养液培养细胞,CTGF处理组在培养液中加入CTGF,使终质量浓度为50 ng/ml.细胞培养后48 h,采用细胞免疫荧光染色技术鉴定HTFs中上皮钙黏素(E-cadherin)蛋白的表达,采用Western blot法对HTFs中E-cadherin蛋白的表达量进行检测.结果 空白对照组及CTGF处理组HTFs均生长良好,呈长梭形,漩涡状排列.细胞免疫荧光染色显示,CTGF处理组HTFs细胞质呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光;空白对照组HTFs仅见DAPI蓝染的细胞核,无E-cadherin表达的红色荧光.Western blot法检测结果显示,空白对照组HTFs中E-cadherin蛋白无表达,而CTGF处理组HTFs中E-cadherin蛋白的相对表达量为0.63±0.08.结论 间叶组织来源的成纤维细胞本身不表达E-cadherin,在CTGF的刺激下成纤维细胞能够表达E-cadherin,CTGF促进HTFs的间质-上皮转分化.     

芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景 青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)的增生是滤过手术失败的丰要原因,寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率. 目的 观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制.方法 斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养,免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs.取第3～5代HTFs接种于96孔板中,加入0、20、40、80、160 μmol/L芹黄素后继续培养,于24、48、72 h后分别取一块96孔板,在酶联免疫检测仪上检测560 nm波长处各组细胞的吸光度(A560)值,磺基罗丹明B(SRB)法测定细胞的增生能力.分别在培养基中加入40、80、160 μmol/L芹黄素,同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10 μg/L BrdU,继续培养48 h,在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片,计算BrdU的标记率,以未添加任何芹黄素(0μmol/L)组为对照组.用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变,采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化. 结果 培养的细胞生长状态良好,免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应,为细胞质中均匀的绿色荧光,确定培养的细胞为HTFs.SRB法检测结果显示,HTFs的增生值(A560)随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降,同浓度芹黄素组HTFs A560值随着作用时间的延长逐渐下降,差异均有统计学意义(F组别=480.306,P=0.000;F时间 =555.144,P=0.000).0、40、80 μmol/L芹黄素作用HTFs 48 h后BrdU的标记率分别为(87.860±0.632)％、(61.520±4.306)％、(23.480±4.472)％,各组之间的总体比较差异有统计学意义(F=299.347,P=0.000),其中40 μmol/L、80 μ mol/L芹黄素组HTFs BrdU的标记率均明显低于0 μmol/L芹黄素组,差异均有统计学意义(P＜0.05).Hoechse 33258染色发现,不同浓度芹黄素组的细胞数目减少,随着芹黄素浓度的增加,细胞核固缩和变形的细胞数目增加.流式细胞术检测发现,随着芹黄素浓度的增加,G0/G1期细胞的百分数逐渐增加,而S期和G2/M期细胞的百分数逐渐下降,差异均有统计学意义(FG0/G1 =58.621,P=0.000;Fs=32.357,P=0.001;Fc2/M =83.998,P=0.000).0、40、80、160 μmol/L芹黄素作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(4.77±0.21)％、(13.24-±1.35)％、(18.33±1.86)％、(31.58±2.77)％,4个组的总体差异有统计学意义(F=204.791,P＜0.05). 结论 芹黄素通过诱导细胞凋亡,并将细胞阻滞于G0/G1期而抑制HTFs的增生,其作用呈剂量和时间依赖性.     

基质金属蛋白酶（MMP-3）及其抑制剂（TIMP-2）在长期使用抗青光眼药物的结膜TENON＇S囊中的表达

目的研究长期应用眼表抗青光眼药物后人的Tenon＇s囊的成纤维细胞中基质金属蛋白酶（MMP-3）及其抑制剂（TIMP-2）的表达,以了解长期局部应用抗青光眼药物后结膜下组织的病理改变。方法收集长期应用抗青光眼药物及无长期应用抗青光眼药物在小梁切除术中切除的结膜及结膜下组织各20例（20只眼）,进行HE染色和马松染色后,在光镜下观察组织学形态,筛选组织标本,进行免疫组织化学检查。结果两组在年龄、性别、诊断之间无差异。用药组A组：用药时间13年;未用药组B组：用药时间790 d。小梁切除术前用两种抗青光眼药的患者为15例,3种以上的患者为5例,未用抗青光眼药的患者20例,用药1年以上的患者20例。在光镜下观察HE和马松染色显示：长期应用抗青光眼药结膜上皮排列不规则,浅基质层为增生的胶原纤维和大量的新生血管伴有炎细胞浸润。在免疫组织化学染色切片,两种抗体染色阳性细胞浆呈程度不同、基本均色棕黄色粗大颗粒反应,反之则为染色阴性。MMP-3和TIMP-2在A、B两组间的表达有差异,P〈0.01,有统计学意义。结论长期应用眼表抗青光眼药物后人的Tenon＇s囊的成纤维细胞中MMP-3及其TIMP-2的表达异常,其临床意义在于长期应用局部抗青光眼药物可以增加组织的改变和增加滤过手术术后的瘢痕形成。