hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞表型的影响

目的 探讨外源性人端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因转染人胚胎成纤维细胞(hEFs)后细胞是否存在恶性表型。方法 应用脂质体法将pIRES2-EGFP-hTERT正义重组质粒及pIRES2-EGFP空载质粒分别导入原代培养hEFs，Western blot分别检测hTERT mRNA和蛋白质的表达。采用染色体核型分析、裸鼠皮下致瘤性实验、DNA倍体实验分析转染细胞是否存在恶性表型。结果 原代培养hEFs中存在较弱水平的hTERT基因mRNA及蛋白质表达，但外源性hTERT基因转染的胚胎成纤维细胞hTERT mRNA及蛋白表达显著增加。hTERT转染后细胞染色体仍为23对，且均为正常二倍体细胞；裸鼠皮下不具有成瘤的能力。结论 外源性hTERT基因转染的胎儿成纤维细胞不具有恶性表型。     

细胞周期蛋白D1反义RNA对胃癌细胞恶性表型的逆转

细胞增殖周期失控是恶性肿瘤无限制增殖的重要原因［１］。细胞周期蛋白Ｄｌ（ｃｙｃｌｉｎＤｌ）作用于决定细跑增殖分化关键时相的Ｇｌ期，其异常高表达被认为可能是肿瘤发生发展的一个重要原因。为了进一步探讨ｃｙｃｌｉｎＤｌ对肿瘤生物学行为的影响及用于基因治疗的...     

反义hTRT转染对SGC-7901胃癌细胞株形态学的影响

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因转染对SGC－7901胃癌细胞株形态学的影响;方法 采用脂质体法将hTRT正、反义真核表达载体导入SGC－7901胃癌细胞株中,从光镜、电镜水平观察转染细胞形态学的变化。结果 与未转染细胞相比,光镜下hTRT反义基因转染的SGC－7901胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比增大,异型性减小;透射电镜下反义基因转染细胞细胞器丰富,胞浆内出现分泌泡样结构及胞质内微囊;扫描电镜下反义基因转染细胞表面微绒毛增多,胞体周围可见大量颗粒样物质,根据AB／PAS染色结果,这些颗粒样物质有可能是其分泌的粘液颗粒。结论 hTRT反义基因有促进SGC－7901细胞分化的作用。     

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的 探讨人端粒酶催化亚单位基因(human telomerase catalytic subunit,hTERT)Ex2-659A/G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系.方法 对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者(病例组)和同期在上述医院查体的健康人群156例(对照组)进行病例对照研究;采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)对2组进行基因型分析,比较各基因型分布频率和发病风险的关系.结果 病例组hTERT Ex2-659A/G位点从、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异.病例组A、G等位基因频率分别为44.74%和55.26%,对照组为43.42%和56.58%,2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异(x2=5.373 4,P=0.020 4).与G/G基因型相比,A/G和A/A 2种基因型的个体患胃癌的危险度(OR)分别为0.519 (95% CI:0.310～0.870,P=0.013)、0.550(95% CI:0.255～1.188,P=0.128).结论 hTERT Ex2-659A/G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素.     

原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位的表达

目的 :研究原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位 (hEST)的表达及其临床意义。方法 :应用RT -PCR方法检测 30例初发急性白血病 (AL)患者、1 2例AL获完全缓解 (CR)患者和 6例正常志愿者骨髓单个核细胞 (MNCs)hESTmRNA的表达。结果 :初发AL患者骨髓MNCshESTmRNA表达量 (0 .71± 0 .34)明显高于CR患者 (0 .4 3± 0 .2 5 ,P <0 .0 5 )及正常志愿者 (0 .2 2± 0 .2 1 ,P <0 .0 1 )。初发AL患者骨髓常规涂片中原始细胞百分率与骨髓MNCs的hESTmRNA表达量呈正相关 (r =0 .4 5 7,P <0 .0 5 )。结论 :初发AL患者骨髓MNCs的hESTmRNA表达增高。hESTmRNA表达可能代表白血病细胞的一种高增殖状态     

不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位的表达

目的:探讨不同年龄正常人外周血淋巴细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达规律。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及凝胶成像技术,检测105例20岁以上不同年龄正常人外周血淋巴细胞的hTERT表达的相对水平。结果:hTERT表达的相对水平在各年龄组分别为:20～29岁,0.557±0.190;30～39岁,0.600±0.360;40～49岁,0.723±0.206;50～59岁,0.498±0.213;60～69岁,0.626±0.203;70～79岁,0.524±0.340;≥80岁,0.702±0.214;各组间差异无显著性(P>0.05)。结论:正常人外周血淋巴细胞中端粒酶催化亚单位水平与年龄无明显相关性,提示端粒酶调控可能既有转录水平也存在转录后因素。     

胃癌组织中端粒酶催化亚单位检测的临床意义

端粒酶是一种核糖核蛋白酶 ,广泛存在于永生化细胞和肿瘤细胞中。在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用。ｈＴＥＲＴ是端粒酶的催化亚单位 ,可以催化端粒酶复制并延长端粒的作用 ,对于维持端粒酶的活性具有决定性作用。因此 ,ｈＴＥＲＴ与肿瘤的关系比端粒酶更为密切 ,有望代替端粒酶活性检测成为肿瘤诊断的指标之一。目前国内对于ｈＴＥＲＴ的研究很少。我们应用ＲＴ -ＰＣＲ方法检测胃癌组织中ｈＴＥＲＴｍＲＮＡ的表达 ,结合其组织病理学资料进行初步分析 ,以了解ｈＴＥＲＴ检测在肿瘤诊断中的临床意义。1　材料与方法1.1组织标本　取…     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

胃癌前病变组织中人端粒酶催化亚单位的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系

目的:探讨胃癌前病变组织中人端粒酶催化亚单位(hTERT)的表达状况及其与幽门螺杆菌(Hp)感染的关系.方法:采用实时定量荧光RT-PCR方法检测胃黏膜中hTERT表达水平,将hTERT与GAPDH拷贝数之比的100倍作为标准化hTERT(NhTERT),用快速尿素酶法和Warthin-Starry银染色法检测Hp.结果:伴肠上皮化生的萎缩性胃炎组织中hTERT表达明显增高(80.9±6.36),而肠上皮化生的Hp感染率明显高于无肠上皮化生者(69%vs31%),Hp阳性患者hTERT表达水平为(101.5±13.50),Hp阴性患者hTERT表达水平为(49.6±8.58),二者相比有统计学意义(P＜0.01).结论:在胃癌前病变阶段,Hp感染与端粒酶表达水平之间有直接关系,呈正相关,提示端粒酶、Hp感染在胃癌的发生、发展中起重要作用.     

hTERT蛋白在胃腺癌组织中定量表达的研究

目的 探讨hTERT蛋白在胃腺癌组织中表达情况及其与胃癌进展的关系.方法 对68例胃腺癌和10例正常组织采用流式细胞术定量检测hTERT蛋白的表达.结果 hTERT蛋白流式细胞术测定在进展期胃癌、早期胃癌和正常胃黏膜荧光指数FI值分别为1.92±0.17、1.60±0.18和0.98±0.15,进展期胃癌hTERT含量高于早期胃癌(P＜0.01)、早期胃癌高于正常胃黏膜(P＜0.01);中、低分化腺癌hTERT蛋白FI值分别为1.89±0.20和1.92±0.19显著高于高分化腺癌1.71±0.19(P＜0.01);有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者(P＜0.05);T1-T2级胃癌TERT蛋白FI值高于T3-T4级胃癌(P＜0.05).结论 hTERT高表达与胃腺癌进展相关,可作为胃癌进展的生物学标志之一.     

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对甲状腺癌细胞凋亡的影响

目的:探讨端粒酶逆转录酶(TERT)的反义寡核苷酸(ASODN)对甲状腺癌(TC)细胞凋亡的影响.方法:体外培养TC细胞,TERT ASODN和正义寡核苷酸(SODN)分别作用于体外培养的TC细胞,采用透射电镜,Hoechest荧光染色,流式细胞仪等方法分析ASODN TERT对TC细胞凋亡的影响.结果:透射电镜示ASODN可诱导TC出现典型的细胞凋亡形态,Hoechest荧光染色显示ASODN可使TC凋亡数目增多从52±16上升到178±32,流式细胞仪证实5 μmol/L ASODN处理组,SODN处理组及空白对照组的细胞凋亡率分别为10.4%,1.6%和无凋亡(P＜0.05).结论:TERT ASODN能增强TC细胞凋亡.     

反义寡核苷酸对视网膜色素上皮细胞中端粒酶逆转录酶表达及细胞增殖的作用

目的:研究视网膜色素上皮(RPE)细胞中端粒酶逆转录酶(TERT)的表达及其反义寡核苷酸(ASODN)对其表达和细胞增生的抑制作用,为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)探索基因治疗新途径. 方法:体外培养兔眼RPE细胞,在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学法检测TERT的表达;不同浓度的TERT ASODN和正义寡核苷酸(SODN)分别作用于体外培养的RPE细胞,采用免疫组织化学方法检测TERT的表达;四唑盐比色法(MTT)检测在不同浓度的TERT ASODN和SODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率. 结果:体外培养兔眼RPE细胞可表达TERT,在5,10 μmol/L ASODN作用下,TERT的表达明显受抑制;TERT ASODN能明显抑制RPE细胞增生活性,并呈剂量依赖性. 结论:一定浓度TERT ASODN能序列特异性地抑制RPE细胞TERT表达和增生活性,有望进一步用于PVR的治疗实验研究.     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

人端粒酶逆转录酶在喉鳞状细胞癌中表达与c-myc的相关性

目的研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA在喉鳞状细胞癌中和病理分级、临床参数的关系以及和c-myc的相关性。方法用原位杂交法检测40例喉鳞状细胞癌中hTERT mRNA的表达,用免疫组织化学法检测c—myc蛋白。结果喉正常组织、不典型增生、鳞癌组织中hTERT mRNA的阳性率分别为0％（0／10）、10％（1／10）、80％（32／40）,喉鳞癌中hTERT mRNA的阳性率明显高于正常组织（P〈0．05）和不典型增生（P〈0．05）,hTERT mRNA水平与c—myc的表达呈显著相关（r=0．5422,P〈0．01）。喉鳞癌中hTERT mRNA表达水平与病理分级不相关（P〉0．05）,与年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移情况不相关（P〉0．05）。结论喉鳞癌中hTERT mRNA的阳性率明显高于正常组织和不典型增生,有助于喉部良恶性病变的鉴别,c-myc的过度表达可能是喉鳞癌端粒酶活性升高的一个重要机制。     

反义hTERT体外抑制白血病细胞增殖的研究

目的研究反义hTERT基因对白血病细胞体外增殖的抑制作用。方法体外通过SuperFect将已构建好的正、反义hTERT真核表达载体转染HL60白血病细胞,再经过G418及PCR筛选鉴定分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞HL60-s和HL60-as。随后运用实时荧光定量RT-PCR技术及TRAP-银染法对各组细胞内源性hTERT mRNA的表达情况及端粒酶的活性进行检测。同时还采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析反义hTERT对白血病细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡。结果与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低HL60细胞内源性hTERT mRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。当各组细胞传至第25代后,与HL60、HL60-s比较,HL60-as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加。结论反义hTERT在体外能抑制白血病细胞的生长增殖能力,其潜在、广谱的抗肿瘤作用的分子生物学机制可能是首先通过抑制和下调hTERT表达(端粒酶活性)而最终引发瘤细胞衰亡的途径来实现的。