rhIL-13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的　在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素-13（rhIL-13）,便于进一步研究开发。方法　根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL-13编码基因片段,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL-13cDNA全长序列;将其插入pPICZαA质粒中,构建成pPICZαA-IL-13表达载体;该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL-13表达阳性菌株;用Western Blotting和ELISA检测发酵上清中IL-13的抗原性和表达量,B     

rhIL—13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素-13（rhIL-13),便于进一步研究开发。方法 根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL-13编码基因片段,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL-13cDNA全长序列;将其托入pPICZαA质粒中,构建成pPICZαA-IL-13表达载体。该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL-3表达阳性菌株;用Western Blotting和ELISA检测发酵上清中IL-13的抗原性和表达量,B9-11细胞株分析其生理学活性。结果 15%—SDS-PAGE显示重组人IL-13分子量约13kd,Western-blotting证实为人IL-13,ELISA测定在摇瓶培养上清表达量达15ug/ml,其生物学活性同标准品一样具有剂量依赖性的刺激B9-11细胞株增殖的作用。结论 成功获得IL-13人工基因和稳定分泌蛋白的基因工程菌株。该重组蛋白的生物学活性达到标准品的要求。     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10     

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。     

重组人类杀菌肽基因在CHO细胞中的表达

目的 检测重组人类杀菌肽基因（BPI）在真核细胞中的表达.方法 采用脂质体转染法将本室构建的pCDNA3.1-BP1500及pCDNA3.1-BPI600重组子导入中国仓鼠卵巢上皮细胞（CHO）,G418筛选出带有重组子的细胞集落,RT-pCR检测BPI在CHO细胞集落中的表达.结果 转染后G418抗性CHO细胞中可检测到BPImRNA的表达.结论 pCDNA3.1-BPI重组子被成功转染至CHO,并得到有效表达.     

人表皮生长因子基因在酵母系统中的表达

酵母细胞被含有α启动子调控下的人工合成的hEGF基因的表达质粒转化.表达出的蛋白能被有效地分泌到培养液中,并被证实为具有生物活性的hEGF。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

目的:盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDR2)是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶,研究DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)软骨破坏和肿瘤转移中的作用.方法:在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段(不含信号肽和跨膜区,命名为DR),并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂.结果:获得了两株较高表达His-DR融合蛋白的毕赤酵母克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%;经Ni-NTA(nitric-tri-acetic acid)柱纯化后,获得了纯度约90%以上的可溶性His-DR融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,His-DR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能.结论:所表达的融合蛋白His-DR具有抑制天然DDR2功能的作用.     

人核迁移蛋白C在毕赤酵母中的融合表达

目的：研究获得人体核迁移蛋白C在毕赤酵母中的高效表达的方法。方法：将重组表达质粒pPICZαA-hNUDC-his用BxtXⅠ单酶切,电击转入Pichia pastoris KM71,采用Zeocin筛选获得转化子。结果：通过优化诱导表达条件使目的蛋白获得较高的表达量。结论：通过优化诱导蛋白表达条件可大幅提高易降解蛋白hNUDC在毕赤酵母KM71中的表达量。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

人TALL-1基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的 研究在毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统中人TALL-1基因的分泌表达,获得具有生物活性的重组TALL-1.方法 将人TALL-1基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,电转化Pichia Pastoris GS115感受态细胞,筛选阳性整合子并进行甲醇诱导表达,采用MTY对表达产物进行初步的生物活性检测.结果 经过诱导表达条件的优化,人TALL-1在酵母培养基BMMY中实现了分泌表达;免疫印迹和酶联免疫检测结果显示,重组产物可以结合其特异抗体;生物学活性检测证实其可抑制Hela细胞增殖.结论 在毕赤酵母系统中实现了人TALL-1的分泌表达,具有生物学活性的重组TALL-1分子可以用于进一步的结构与功能研究.     

唾液Histatin 5突变体在巴斯德毕赤酵母中的优化表达

目的通过优化重组毕赤酵母GS115-pPICZα-A-HRP5′表达条件,提高表达水平,增强产物抗菌活性。方法将培养基甘油含量、pH、诱导前培养时间、甲醇诱导量、诱导后培养时间设置不同梯度,采用琼脂孔穴扩散法比较各梯度下表达产物抗菌活性。结果以pH6.0、甘油含量2.0%YEPG培养基、培养30h后用1.5%甲醇诱导培养48h,表达产物抗菌活性最高。结论优化条件为HRP5′的大规模发酵奠定了基础。     

异种同源表皮生长因子受体EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的表达

目的　实现异种同源表皮生长因子受体 EGFR胞外段在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达。方法　将鼠和人的 EGFR胞外段目的基因 (mer,her)与分泌型毕赤酵母表达载体 p PICZa A重组 ,构建了相应的重组表达质粒 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her,用 Sac 将重组质粒线性化后 ,电穿孔转化酵母菌株 GS115 ,利用 Zeocin筛选阳性克隆 ,挑出阳性克隆用甲醇小规模诱导表达后 ,进行 SDS- PAGE分析及 Western- blot检测 ,筛选高表达量的克隆作大规模诱导表达。结果　获得了鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白在毕赤巴斯德酵母中的分泌性表达 ,SDS-PAGE分析及 Western- blot检测得到预期条带 ,相对分子质量约为 95× 10 3。免疫印迹分析表明 ,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论　 p PICZa A- mer和 p PICZa A- her重组质粒在甲醇营养型酵母中可经甲醇诱导表达鼠和人的 EGFR胞外段目的蛋白。     

外源蛋白在毕赤酵母表达系统中高效表达的培养条件的优化策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的真核外源蛋白表达系统之一。本文从培养基的成分、培养温度、培养基的pH值，溶解氧的量和甲醇浓度等角度对国内外在毕赤酵母表达系统中高效表达外源蛋白的培养条件的优化策略做了较详细的综述．     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

基因工程酵母菌来源的D-氨基酸氧化酶分离纯化

目的以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。方法采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephacryl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的DAAO。结果超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12000U／mL。两步硫酸铵沉淀能粗分DAAO,50％硫酸铵沉淀酶回收率可达85％以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达90％,SDS-PAGE显示单一蛋白条带。结论本实验方法能得到电泳纯的DAAO,总回收率约为40％。     

TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定

目的 表达并纯化TAT-N24穿膜融合多肽,初步探讨其生物学活性.方法 构建pTAT-HA-N24原核表达载体,在BL21大肠埃希菌中表达并纯化TAT-N24融合多肽,利用SDS凝胶电泳检测纯化蛋白的纯度,利用免疫细胞化学和流式细胞术检测TAT-N24融合蛋白的穿膜能力和生物学活性.结果 在原核表达系统中成功构建并表达纯化了TAT-N24穿膜融合多肽,其在6 mol/L尿素和DMSO中均具有较好的溶解性,纯化的融合多肽经SDS凝胶电泳分析未见明显杂蛋白混入,利用免疫细胞化学染色可见TAT-N24处理结肠HT29细胞12 h后90%以上的细胞中可检测到TAT-N24,流式细胞术检测细胞周期可见TAT-N24能够有效地诱导细胞周期阻滞,抑制结肠癌细胞生长.结论 TAT-N24具有高效的穿膜能力,并能有效抑制结肠癌细胞增殖,可望开发成为有效的肿瘤分子治疗药物.     

Expression of Recombinant Human Lysozyme-tachyplesin I (hLYZ-TP I) in Pichia Pastoris and Analysis of Antibacterial Activity

Antimicrobial peptides(AMPs)are making headlines in science because they demonstrate superior microbicidal characteristics compared to synthetic and semi-synthetic antibiotics [1].Importantly,AMPs kill pathogens via a different mechanism compared to antibiotics [2].Therefore,