转染SV40永生化基因正常成人肝细胞的形态观察

目的了解转染SV40基因对正常成人肝细胞形态结构及特殊染色的影响。方法采用本组构建的含SV40永生化基因的正常成人肝细胞（rSSR#69/HL-7702肝细胞）,以HE染色法、糖原染色法（PAS）和葡萄糖-6-磷酸酶染色（G-6-Pase）法,在光镜下观察该细胞的形态特征,以电镜法观察该细胞的超微结构。结果：光镜下比较转染前、后的正常成人肝细胞形态无明显差异;PAS染色均可见胞浆内有粉红色的糖原颗粒,G-6-Pase染色均可见胞质内有铁黑色颗粒;电镜下比较转染前、后的正常肝细胞的超微结构亦无统计学差异。结论：转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞的形态结构与转染前无明显差异,仍具有糖原合成及葡萄糖代谢的能力。     

携带SV40T/HSV-tk基因永生化正常成人肝细胞的构建

目的构建永生化正常成人肝细胞为生物型人工肝提供安全有效的人肝细胞源。方法转染包装细胞,获得逆转录病毒;将该病毒感染正常成人肝细胞HL-7702;更昔洛韦毒性实验检测转染后肝细胞内HSV-tk基因;RT-PCR法检测转染后细胞内SV40T的mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色检测转染后细胞内SV40T基因的蛋白表达。结果更昔洛韦检测转染后的肝细胞存活良好,而转染前的肝细胞死亡。RT-PCR法显示转染后的肝细胞内存在SV40T mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色法显示转染后肝细胞内存在SV40T蛋白。结论转染后的正常成人肝细胞中含有SV40T和HSV-tk基因,并表达相关蛋白。     

永生化肝细胞系研究进展

原代肝细胞由于体外生存期短培养困难而限制了它的应用，近年来随着分子生物学的发展使正常细胞永生化成为可能。肝细胞的永生化对于药物毒理、生物人工肝脏支持以及肝脏组织工程的研究都具有非常深远的意义。本文就近年国外学者构建的永生化肝细胞系及相关研究作一阐述，并讨论其应用前景和可能面临的问题。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养，以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况；应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长，长期传代(50代)仍有很强的增殖能力，形态呈现多角形和三角形，GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞,构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

永生化肝细胞移植治疗肝衰竭

目的: 观察永生化胎肝细胞及胚胎肝细胞经脾脏移植对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法: 采用D-gal诱导大鼠急性肝衰竭,分3组进行治疗实验,Ⅰ组: 经脾脏移植永生化胎肝细胞2×107个;Ⅱ组: 移植原代胚胎肝细胞2×107个;Ⅲ组: 脾脏注射生理盐水1 mL,各组大鼠同时肌肉注射环孢霉素A(CsA) 10 mg/kg. 观察大鼠的存活率、肝脏功能、肝脏病理变化情况. 结果: Ⅰ组及Ⅱ组大鼠存活率均显著高于Ⅲ组大鼠(72.2% vs 22.2%, 61.1% vs 22.2%, P＜0.01),肝脏功能及肝脏病理均有改善, Ⅰ组与Ⅱ组之间大鼠存活率无明显差异(72.2% vs 61.1%, P＞0.05). 结论: 经脾脏移植胚胎肝细胞可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,改善肝功能及肝脏病理,该永生化胎肝细胞可以成为肝细胞移植研究中的理想细胞材料.     

hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

星形胶质细胞的永生化研究

星形胶质细胞（astrocyte，AST）是中枢神经系统内主要的神经胶质细胞，其功能复杂且分布广泛，已经成为生命科学研究的热点。体外细胞培养是研究AST生物学特性和生理学功能等的主要方法之一。然而，体外培养的AST增殖周期有限，多次连续传代后，常因复制衰老而死亡，难以获得较多性状一致的细胞，给研究带来很大不便。因此，学者们提出建立永生化的星形胶质细胞株，使体外培养的细胞具有无限增殖的能力且在一定范围内保持细胞生物学特性的相对稳定。本文拟对近年来AST永生化的研究进行综述。     

增强型绿荧光蛋白基因修饰永生化大鼠肝细胞的实验研究

目的：建立携带示踪标记的永生化大鼠肝细胞系。方法：用脂质体转染法将增强型绿荧光蛋白（EGFP）基因转入永生化大鼠肝细胞中。结果：转染3d后，在荧光显微镜下观察，对照组肝细胞不发荧光；实验组肝细胞发绿荧光，转染率为41%，经G418筛选后得到稳定表达的肝细胞。结论：应用基因转染技术将EGFP基因转入永生化大鼠肝细胞中并获得稳定表达。     

原代培养大鼠肝细胞的基因转染

目的：研究原代培养大鼠肝细胞的基因转染的方法．方法：采用胶原酶灌注法获取原代培养大鼠肝细胞．利用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(GFF)和Neo基因的真核细胞表达载体(pEGFP-N3)转染原代培养大鼠肝细胞．用荧光显微镜观察和Neo基因原位杂交染色方法检测肝细胞内基因表达情况．结果：获取的原代大鼠肝细胞活细胞率达95％,荧光显微镜下观察可见转染基因的细胞可发出绿色荧光,原位杂交显示有Neo基因的表达．结论：pEGFP-N3基因可转入大鼠肝细胞并获得表达,可用于标记原代培养的大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后移植的肝细胞在体内的分布及功能．     

人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞对T细胞的激活效应

目的：采用Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA电转染人外周血树突状细胞（Dendritic Cell,DC）,观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法：通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,用细胞因子体外培养诱导其成为DC。Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA。通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入DC内;通过混合淋巴细胞实验,获取DC激活的特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞的增殖率。结果：电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入DC;电转染前后DC分子表达无显著差异。转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异的激活T细胞且增殖率明显增强（P〈0.05）。结论：电转染为人肝癌细胞总RNA导入DC提供技术上的可行性;转染了人肝癌细胞总RNA的DC可特异激活T细胞。     

脂质体介导SV40LT基因转染构建羊水染色体核型分析质控细胞系研究

目的: 研究羊水染色体核型分析质控细胞系的构建方法。方法: 以T4 DNA连接经BamHⅠ单酶切的SV40LTag-pcDNA和pcDNA3.1（-）DNA,重组SV40LTag-pcDNA3.1（-）克隆,以脂质体介导法将重组克隆转染至染色体结构异常的羊水细胞,以G418筛选阳性克隆,观察细胞系的传代生长特性及其作为染色体核型分析质量评估的可行性。结果: 构建了染色体核型为46,XY,t（8;19）（q24.3;q13.1）的羊水细胞系,传至第15代的细胞系经染色体核型分析,其核型与原代细胞一致。结论: 染色体结构异常的羊水细胞转染SV40LT基因后可转化为无限扩增且染色体核型稳定的细胞系,从而制成羊水细胞染色体核型分析的质控细胞系。     

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：研究SV40大T抗原（LT）基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用，以及转化后细胞生物学特性的改变。方法：采用脂质体介导的方法。利用含有LTcDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞。G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达。以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况。结果：分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LTmRNA在转染细胞质中表达。免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达。细胞计数，BrdU，流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡。结论：LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡，所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式。     

多药耐药基因转染对人胎盘源性间充质干细胞生物学特性影响研究

目的 将多药耐药基因(mdrl)通过逆转录病毒载体导人人胎盘源性间充质干细胞(PMSCs),评价耐药基因导人对P-MSCs干细胞特性的影响.方法 采用胰酶消化法自人足月胎盘组织中分离培养间充质干细胞(MSCs),将含有mdr1基因和绿色荧光蛋白(CFP)报告基因的重组逆转录病毒载体转染P-MSCs;应用流式细胞术检测转染后P-MSCs表型特征,四唑盐比色法和碘化丙啶标记测定其增殖活性和细胞周期,透射电镜下观察转染P-MSCs超微结构变化,条件培养液诱导法分析转染后P-MSCs向脂肪细胞、成骨细胞定向分化能力.结果 转染P-MSCs表达干细胞表面标志,如CD29,CD44和CD73,细胞倍增时间为23.9 h,生长周期仍符合干细胞增殖的特点,超微结构观察转染P-MSCs表面微绒毛增加,细胞内线粒体丰富,粗面内质网轻度扩张,且在特异诱导条件下具有向成脂、成骨定向分化潜能.结论 mdr1基因体外转染人P-MSCs对其干细胞特性无显著影响,这可为P-MSCs在大剂量肿瘤化疗中的应用提供实验参考.     

采用多药耐药基因mRNA转染人单个核血细胞提高对化疗药物耐药性的体外研究

目的：采用将人多药耐药基因（MDR1）mRNA导入人单个核血细胞的方法,观察跨膜糖蛋白(P-gp)在转染后单个核血细胞中的表达和功能情况,并初步探讨此方法中影响P－gp表达和功能的因素。方法：体外分别合成无5′和3′UTR（非翻译区）的MDR1 mRNA[pGEM5Zf( )-MDR1]和使用Xenopusβ-globin的5′和3′UTR替代野生型5′和3′UTR的MDR1 mRNA(pT7TS-MDR1),从而构成两个试验组。然后利用脂质体为介质转染富含造血细胞的人单个核血细胞, 式细胞技术对MDR1基因的翻译产物P-gp的表达和功能进行检测。结果：转染后12h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．16％,pGEM5Zf( )-MDR1组为8．94％,pT7TS-MDR1组为19．14％;转染后72h人单个核血细胞P-gp的表达：阴性对照组为2．12％,pGEM5Zf( )-MDR1组为6．12％,pT7TS-MDR1组为25．29％,pT7TS-MDR1组为35．02％。结论：转染后12h及72h两试验组都表现出P-gp的高表达,并且以pT7TS-MDR1组为优;转染后细胞对P-gp的表达及存在可以维持至少72h;表达的P-gp具有外排泵功能。MDR1 mRNA转染人单个核血细胞具有提高其对化疗药物耐药性的潜质。     

TMSG-1基因转染对肿瘤转移表型的影响

目的：研究肿瘤转移抑制基因TMSG-1对肿瘤转移表型的影响。方法：将含TMSG-1全长开放阅读框架的1.5kb cDNA克隆于pcDNA3，构建正义及反义TMSG-1 cDNA真核表达载体，以脂质体转染人肺巨细胞癌PG的高转移亚系BE1，挑选G418抗性克隆，RT-PCR检测正义或反义TMSG-1cDNA在转染细胞中的表达，进行转染细胞体外肿瘤生物学行为检测。结果：RT-PCR显示正义TMSG-1cDNA转染的BE1细胞（BE1-S）中TMSG-1表达明显高于BE1及空载体对照细胞，反义TMSG-1cDNA转染细胞（BE1-AS）中TMSG-1表达低于空载体对照细胞。与BE1及空载体对照细胞（BE1-V）相比，BE1-AS细胞体外生长较快，软琼脂克隆形成能力明显增强；而BE1-S细胞体外生长能力没有显著改变，但其穿越Matrigel的能力及软琼脂克隆形成能力明显减弱。流式细胞仪分析结果显示BE1-S的G0、G1期的细胞较BE1-V细胞比例增多，并且BE1-S出现了细胞凋亡峰。结论：实验结果表明反义TMSG-1基因转染可增强BE1细胞的体外生长、体外侵袭能力及克隆形成能力。而正义TMSG-1基因转染则使BE1细胞的侵袭能力及软琼脂克隆形成能力减弱，而对细胞体外生长能力无明显影响。结论支持TMSG-1是一个肿瘤转移抑制基因。     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

转染节律基因mPeriod2对小鼠正常细胞放射损伤的影响

目的评价mPeriod2（mPer2）基因转染后过表达对小鼠肺成纤维细胞NIH3T3放射损伤的影响。方法采用脂质体介导法将roPer2基因转染人NIH3T3细胞中，以空质粒pcDNA3.1和空白组为对照，采用流式细胞术检测mPer2基因在NIH3T3细胞中的表达，经过^60Co—γ射线放射处理后，用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期分布，采用平板克隆形成试验检测细胞增殖情况。结果射线照射后，与pcDNA3．1空质粒组和空白对照组相比，pcDNA3．1-mPer2转染组凋亡率下降，S期细胞所占比例增高，克隆形成率明显增高。结论节律基因mPer2过表达会使γ射线照射后的NIH3T3细胞凋亡下降，增殖加快，减弱了细胞的放射损伤。