人骨髓间充质干细胞分离方法的比较

目的:探讨人骨髓间充质干细胞原代培养过程中最佳的分离方法。方法:留取暨南大学第一附属医院骨科2004-10/2005-06健康供者的骨髓10份,分别采用羟乙基淀粉沉淀法,淋巴细胞分层液分离法,氯化铵裂解红细胞法,全骨髓法四种方法分离骨髓有核细胞,观察四种方法在细胞出现伸展的时间,原代培养的时间方面的差异,流式细胞仪对培养得到的间充质干细胞进行表面标志检测。结果:①在其他条件相同的情况下,羟乙基淀粉沉淀法10份标本全部培养成功,淋巴细胞分层液分离法10份中有9份得到间充质干细胞,氯化铵裂解红细胞法10份中仅1份得到间充质干细胞,全骨髓培养法10份中有3份得到间充质干细胞。②羟乙基淀粉沉淀法细胞出现伸展和原代培养的时间短于淋巴细胞分层液分离法犤乙基淀粉沉淀法:羟(54.0±3.0h,(12.4±1.4)d;淋巴细胞分层液分离法:(74.0±5.2)h,(14.6±0.9)d,)P<0.01犦③流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面表达CD13,CD29,。CD44,不表达造血细胞的标志CD45,CD34。结论:经比较羟乙基淀粉沉淀法明显优于其他分离方法,在人骨髓间充质干细胞的培养过程中建议使用此种物理沉降方法分离骨髓有核细胞。     

人胎盘间充质干细胞4种消化分离方法的效果比较

背景:目前已从多种组织器官中分离出间充质干细胞,如何更高效地获取大批量纯度佳的干细胞仍是研究目标之一.目的:对人胎盘间充质干细胞采取4种不同的消化分离方法,比较其分离效果.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-07/2008-01在暨南大学医学院血液病研究所完成.材料:胎盘标本来源于足月正常剖宫产胎儿,由暨南大学附属第一医院提供.胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ为GIBCO产品,羟乙基淀粉为B.BRAUN产品,淋巴细胞分层液为上海试剂二厂产品.方法:胎舷组织剪碎后甲均分为4组:胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+氯化铵裂解红细胞组,5份标本/组.将第1组置于1 g/L胶原酶Ⅳ中,另外3组置于1 g/L胶原酶Ⅱ中,37℃消化45 min.过筛后收集各组细胞悬液,按组别对应施以羟乙基淀粉沉淀法、淋巴细胞分层液分离法、氯化铵裂解红细胞法进行分离.主要观察指标:观察4种方法在获取细胞数、培养成功率、细胞出现伸展时间、原代培养时间方面的差异,并对培养得到的细胞进行表面标志检测.结果:与胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组比较,其余3组获取的细胞数均明显减少(t=2.92～8.16,P<0.05).在其他条件相同的情况下,胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100%.其余3组分别为80%,80%,20%.胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组细胞出现伸展时间及原代培养时间均短于胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组(t=5.27～5.37,P<0.05).亦短于胶原酶Ⅳ+羟乙沉淀组(2.46～2.50,P<0.05).流式细胞仪检测示第3代人胎盘间充质干细胞强表达透明质酸受体CD44和整合素家族成员CD29,不表达造血干细胞标志CD34和CD45,也不表达内皮细胞标志CD106及HLA-DR.结论:使用胶原酶Ⅱ消化胎盘组织,结合羟乙基淀粉沉淀法能较好地分离人胎盘间充质干细胞.     

人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

背景:目前所报道的脐带血间充质干细胞体外培养条件不尽相同,尚缺乏统一标准,且培养效率较低.目的:拟对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-04在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室完成.材料:35份脐带血标本来源于北京协和医院妇产科顺产或剖宫产胎儿.方法:应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分别从脐带血中获得单个核细胞.细胞接种后,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12、L-DMEM和MesencultTM不同培养基,在不同体积分数胎牛血清(5%,10%,20%)、不同细胞接种密度(5×106,1×107,5×107,1×108)下进行细胞培养.细胞传至第3代诱导成骨,行Von Kossa染色.主要观察指标:不同分离方法、培养基、胎牛血清浓度、种植密度分离培养细胞的效果,脐带血间充质干细胞表面标记的表达及成骨情况.结果:与淋巴细胞分离液法比较,羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法获得的单个核细胞数量明显增多(P＜0.05,P＜0.01),羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法细胞原代培养时间显著短于另2种方法(P＜0.01).应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时,培养效率高于其余各种条件组合(P＜0.01).贴壁细胞表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45,CD90及CD133,经成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色可见黑色矿化结节.结论:应用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法可以获得较多数量的脐带血单个核细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或Mesencult TM培养基、细胞接种密度为5×107时可以提高脐带血间充质干细胞的培养效率.     

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧神经元修复的体外实验

目的：观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧新生大鼠大脑皮质神经元活性的影响。方法：实验于2005—01／2006—12在兰州大学第一医院中心实验室完成。健康Wistar大鼠成鼠5只，健康新生Wistar大鼠20只，无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，细胞融合达90％时更换培养基培养24h，收集细胞培养液即为骨髓间充质干细胞条件培养基；无菌条件下培养新生Wistar大鼠大脑皮质神经元，第8天随机分为正常对照组、缺氧组、间充质干细胞条件培养基处理组，即用骨髓间充质干细胞条件培养基进行缺氧神经元的修复。分别于缺氧0h、缺氧6h、复氧24h用噻唑蓝盐比色法测定吸光度值和BeckMan全自动生化仪测定培养液乳酸脱氢酶漏出量，分别检测各组神经元的活性和细胞损伤后修复的程度。结果：各实验组均全部进入结果分析。①各组神经元的活性：鼠大脑皮质神经元缺氧6h及复氧24h后缺氧组噻唑蓝明显低于正常对照组，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组复氧24h后噻唑蓝高于缺氧组（缺氧6h：缺氧组0.42&;#177;0.14，正常对照组0．81&;#177;0.12；复氧24h：缺氧组0.35&;#177;0.15，正常对照组0.82&;#177;0．21，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组0.74&;#177;0．25，P〈0．01或0.001）。②各组细胞损伤后修复的程度：缺氧6h和复氧24h后，缺氧组乳酸脱氢酶漏出量比正常对照组明显增多，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组比缺氧组明显减少[缺氧6h：缺氧组（790．16&;#177;34．51）nkat／L，对照组（340．07&;#177;25．17）nkat／L，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组（570．11&;#177;53．18）nkat／L；复氧24h：缺氧组（1790．36&;#177;252．38）nkat／L，对照组（340．07&;#177;19．00）nkat／L，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组（860．17&;#177;40．17）nkat／L，P〈0．001]。结论：在体外培养条件下骨髓间充质干细胞能增加缺氧神经元的细胞活性，促进缺氧神经元的修复。     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞体外构建纤维蛋白胶软骨模块

目的：观察体外构建骨髓间充质千细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法：实验于2004-07／12在南方医科大学附属珠江医院中心实验室进行。选取新西兰兔10只，密度梯度法分离培养兔骨髓间充质干细胞，在培养系统中加入生长因子（含10μg/L转化生长因子β1，100mol／L地塞米松，50mg／L维生素C，以及1％ITS-A。培养第2,4，6，8天采用四甲基偶氮噻唑法在酶标仪上检测吸光度值表示细胞增殖。于培养7，14d行细胞爬片甲苯胺蓝染色及Ⅱ胶原免疫组化。诱导后骨髓间充质干细胞种植于改良纤维蛋白胶支架上，加入生长因子诱导培养，于培养7，14，21d行形态组织学及透射电镜检查。结果：实验兔10只均进入实验结果分析。①四甲基偶氮噻唑法测定培养第6和8天后，实验组骨髓间充质干细胞增殖的吸收度值高于对照组（实验组：0．4554&;#177;0．0206，0．5348&;#177;0．0169；对照组：0．4270&;#177;0．0255，0．5057&;#177;0．0368，P〈0．05）。②细胞爬片甲苯胺蓝染色细胞周围有蓝色基质。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。③诱导后骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架中培养，Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原的形成；Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。透射电镜可见细胞代谢旺盛。结论：骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程模块体外培养系统中，改良纤维蛋白胶支架相容性好，转化生长因子β等生长因子促进骨髓间充质干细胞在改良纤维蛋白胶支架增殖，诱导分化成软骨细胞表型。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养——贴壁分离和消化控制相结合可否为简便高效的技术方法

目的：对骨髓间充质干细胞的培养一般采用流式细胞仪分离法及密度梯度离心法和免疫磁珠分离法，本实验观察了采用贴壁分离和消化控制相结合方法分离纯化的可行性。方法：实验于2004—09／12在锦州医学院附属第一医院外科实验室完成。选取6—8周龄的SD大鼠，雌雄不限，从其股骨、胫骨中取材，在无菌条件下操作，用剪刀分别剪去股骨胫骨的两端，暴露骨髓腔，用含有体积分数为0．15的胎牛血清Dulbecco改良培养基从骨髓腔中冲出骨髓于平皿中，用含有体积分数为0．1的胎牛血清的Dulbecco改良培养基培养，用消化控制及贴壁分离法分离纯化骨髓间充质干细胞，并观察其生长状态，测定骨髓间充质干细胞的生长曲线，分裂指数，贴壁率，用免疫细胞化学方法对骨髓间充质干细胞进行表型分析。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈椭圆型、短梭型、长梭型、多角型等。纯化、扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭型，第6代前生长性状稳定，增殖能力强。传代周期为7d，每次传代时细胞活力测定均&;gt;97％，传代后24h内贴壁率99％。免疫细胞化学检测第3代细胞均匀表达CD54(ICAM-1)、纤维连接蛋白。结论：实验建立了一种可行的大鼠骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增方法。培养的骨髓间充质干细胞纯度高，细胞活力强，生物学性状稳定。本实验通过贴壁分离和消化控制相结合的培养方法具有操作简便，条件要求低等优点，是目前一种比较理想的分离纯化方法。     

骨损伤刺激对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的：观察骨损伤性刺激对骨髓间充质干细胞的影响，为体内诱导骨髓间充质干细胞增殖提供方法。方法：实验于2004-07／2005-03在南华大学附属第一医院临床研究所完成。选取健康SD大鼠18只，每组9只，随机分成两组，一组为观察组，进行一侧闭合性股骨横断性骨折损伤模型处理，另一组为对照组不作骨折损伤处理，两组大鼠同等条件下饲养2周，然后取出双侧股骨进行骨髓间充质干细胞提取，流式细胞仪检测含CD44一FrrC阳性而CD45一砌）E阴性的细胞的构成比（骨髓间充质干细胞具有表现为CD44阳性而及CD45阴性的特点，因此把通过流式细胞仪检测到的CD44-FTTC阳性同时CD45-RPE阴性的细胞认定为骨髓间充质干细胞，由此测得的该细胞数占总检测细胞数的比为骨髓间充质干细胞构成比），计算出两组骨髓间充质干细胞构成比均数。，结果：实验大鼠18只均进入结果分析。①观察组处理侧骨髓间充质干细胞构成比均数高于对照组处理侧（29．19&;#177;5．06，13．05&;#177;9．08，P〈0．01）。②观察组未处理侧股骨骨髓间充质干细胞构成比均数高于对照组未处理侧（22．90&;#177;5．44，14．12&;#177;8．98，P〈0．01）。⑨观察组处理侧股骨骨髓问充质干细胞构成比均数低于未处理侧（29．19&;#177;5．06，22．90&;#177;5．44，P〈0．05）。结论：骨损伤后骨髓间充质干细胞出现增殖，为骨折的愈合提供物质基础，提示骨损伤性刺激可作为活体内诱导骨髓间充质干细胞增殖的一种方法。     

动脉再生机制研究：骨髓间充质干细胞诱导分化内皮样细胞的体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞体外扩增及其向内皮样细胞定向分化条件。方法：无菌条件下采集兔骨髓，肝素抗凝，经淋巴细胞分层液(相对密度为1.077)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞，通过贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cell，MSC)，然后在内皮细胞生长环境中进行诱导分化，观察细胞的体外生长特点及其生化特性。结果：MSC每扩增一代，细胞数量增加5～8倍，7.65&;#215;10^3个原代MSCs体外扩增3代即获得1.26&;#215;108个细胞。特定条件下贴壁细胞延展呈梭形，形成细胞簇、索状结构及“铺路石”样结构，扩增细胞免疫组化证实表达CD31和VIII因子相关抗原(factor VIII related antigen von Wille-brand factor，vWF)。具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白的功能。结论：．MSC扩增能力强，在体外能诱导其向内皮细胞方向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞的潜能

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞能力。方法：①实验于2004-09／2005-01在南京医科大学第一附属医院内分泌及代谢病研究室完成。选用清洁级雄性SD大鼠10只。②取大鼠骨髓，体外分离、培养骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测CD45／CD90表达及细胞周期，明确骨髓间充质干细胞特性。③取第3代细胞，随机分为2组，低糖诱导组[先予体积分数0．1胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液（5.6mmol／L葡萄糖）]或高糖诱导组[高糖Dulbecco改良的Eagle培养液（25mmol／L葡萄糖）1培养14d，换予体积分数0．05胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液或高糖Dulbecco改良的Eagle培养液＋尼克酰胺（10mmol／L）培养7d，再加Exendin-4（10nmol／L）诱导培养7d。④采用反转录聚合酶链反应法检测胰腺一十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因的表达，激光共聚焦显微镜观察胰岛素蛋白的表达，流式细胞术检测胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度，电镜观察诱导后细胞的超微结构。⑤组间计量资料比较采用方差分析。结果：①骨髓间充质干细胞贴壁生长，呈长梭形。流式细胞术检测显示，CD90阳性率为（96．3&;#177;1．3）％，CD45阳性率为（0.3&;#177;0．4）％，细胞周期静止期-DNA合成前期占（76．8&;#177;4．8）％，DNA合成后期一有丝分裂期（11．3&;#177;3．7）％，DNA合成期（11．9&;#177;5．7）％。②骨髓间充质干细胞诱导培养过程中，细胞形成团簇状分布，少数聚集成团，直径80～200μm，半悬浮于培养瓶中。电镜观察此类细胞胞浆内有较多分泌颗粒。③低糖诱导组和高糖诱导组均表达胰腺-十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因。④流式细胞术检测显示低糖诱导组和高糖诱导组胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度均明显高于骨髓间充质干细胞诱导前[（21．9&;#177;11．1）％，（19．8&;#177;7．8）％，（1．4&;#177;1.2）％；21．0&;#177;7．6，22．5&;#177;14．5，8．7&;#177;3．5，P〈0．051。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为胰岛素阳性细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

护士选择性应用静脉留置针现状分析

[目的]了解护士选择性应用留置针的现状以及主要影响因素,为指导临床留置针合理应用提供理论依据。[方法]采用自设问卷对138名护士留置针选择性使用情况及其影响因素进行调查。[结果]约1／4的护士并不知道应选择性使用留置针,近60％的护士在实际工作中选择留置针的意识较差;护士选择性应用留置针的决策受多因素影响;不同科室、职称及是否具有带教资格选择性应用留置针的影响因素不尽相同;绝大部分护士希望参加选择性应用留置针相关内容的培训。[结论]临床护士操作前考虑留置针选择的意识有待加强。建议实施有针对性的培训以提高护士选择性应用留置针的能力。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。