抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体(scFv)筛选

目的筛选出抗SARS-CoV病毒N蛋白的单链抗体。方法利用原核表达所获得的SARS病毒N蛋白,筛选人源单链抗体噬菌体展示库,经特异性的检测,以期得到抗SARS-CoV病毒N蛋白的特异单链抗体。结果获得了8个抗SARS病毒N蛋白的候选克隆。经测序,获得了编码抗体可变区的基因序列,并进行了原核表达。结论筛选得到的抗SARS-CoV病毒N蛋白单链抗体具有高度的特异性,可以用作临床实验或研究SARS病毒过程中快速检测SARSN蛋白或SARS病毒粒子的候选抗体。     

SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响

N蛋白位于SARS冠状病毒（SARS-CoV）颗粒的核心，是SARS-CoV的主要结构蛋白之一，它可以与病毒基因组RNA结合。目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1（activator protein 1）信号转导途径；并发现在压力条件下（即缺乏生长因子时），N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组。本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化。通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理，得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱。N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关。     

MAP30苦瓜抗HIV蛋白对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的：研究MT为3000的苦瓜抗HIV蛋白(MAP30)对2．2．15细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法：将HBV DNA转染的人肝癌细胞株2．2．15，在MAP30存在的情况下培养后，进行间接免疫荧光染色，用共聚焦技术定量分析细胞内HBeAg的表达。结果：与对照组相比较，MAP30培养的细胞内HBeAg荧光量明显减少。结论：MAP30对2．2．15细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用。     

SARS-CoV N基因重组腺病毒对树突状细胞前炎症细胞因子mRNA表达和分泌的影响

目的 探讨严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)感染后炎症细胞因子的mRNA表达和分泌水平的动态变化,在蛋白质水平上阐明SARS-CoV的致病机理.方法 本研究在建立树突状细胞(dendritic cells,DC)培养方法的前提下,利用SARS-CoV的N基因重组腺病毒(rAd-N)和对照的腺病毒(rAd-LacZ)来感染成熟的DC,用RT-PCR和ELISA法检测DC对IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a的mRNA表达和分泌水平的变化.结果 IL-6和TNF-a mRNA的表达和分泌水平在前24 h之内是逐渐升高的,与对照组(rAd-LacZ感染)相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 SARS-CoY的N蛋白与SARS的急性期DC分泌过量的前炎症细胞因子有关.     

SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析

目的克隆表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43)核衣壳(N)蛋白,并对其重组蛋白的抗原相关性进行探讨。方法RT-PCR扩增SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的N基因全长序列,克隆到原核表达载体pQE30,IPTG诱导表达重组蛋白,用Westernblot和免疫荧光鉴定。结果获得SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43His-N融合蛋白的相对分子质量(Mr)分别约为47×103、44×103、50×103,与相应预测值相符,Westernblot和免疫荧光证实,3种融合蛋白仅与相应的免疫血清特异性结合,3种蛋白的抗原性相互间无交叉反应。结论获得具有免疫原性的SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的核衣壳融合蛋白,其3种N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应。     

质粒介导的RNAi抑制SARS-CoV复制和感染

目的研究RNAi作为治疗SARS-CoV感染新策略的可能性。方法选择并克隆针对SARS-CoV编码基因的共同前导序列非结构蛋白-1(Non-structureprotein1,NSP1)的siRNAs;RT-PCR和FACS法检测所选取的siRNAs对NSP1基因抑制的特异性和有效性;利用MTT法检测选取的siRNAs对病毒感染的细胞生存率的影响;空斑形成实验证实在siRNAs存在下病毒量减少情况;RT-PCR和Western-blot法进一步证实感染细胞中S和N基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果结果显示重组质粒衍生的靶向SARS-CoVNSP1的siRNAs能特异地抑制靶序列表达;在体外培养的VeroE6细胞中能显著抑制SARS-CoV的复制与繁殖。感染1d后,RT-PCR和Western-blot结果显示,同对照组相比,SARS-CoV的S和N基因的mRNA和蛋白质表达均显著减少。结论NSP1序列是SARS-CoV的RNAi策略的有效靶标,这些siRNAs很可能广泛地抑制了SARS-CoV亚基因组的合成及随后的蛋白质表达。     

重组SARS-CoV核衣壳蛋白的表达及免疫原性研究

我们利用全基因合成方式及原核表达系统获得大量纯化的N蛋白，为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究提供新的思路。由于长片段目的基因在原核系统中不易表达，根据抗原性预测分析将N蛋白分成两部分表达，第一部分为N-4蛋白1-549bp，第二部分为N-2蛋白496-1269bp，上下游分别设计BamH Ⅰ、     

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的克隆表达及其临床应用研究

目的　克隆、原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)核衣壳 (N)蛋白 ,分析、评价其抗原性和在SARS血清学诊断中的应用价值。方法　采用逆转录巢式聚合酶链反应 (RT-nested PCR)扩增SARS CoV的N蛋白基因 ,克隆入pBAD-Thio TOPO原核表达载体 ,表达、纯化重组融合N蛋白 ,WesternBlot分析其抗原性和特异性 ,建立以重组N蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法 ,并与以全病毒裂解液为抗原的ELISA法进行比较。结果　重组表达载体经诱导产生了高水平的重组融合N蛋白 ,融合蛋白经亲和纯化后 ,具备了较高的纯度和抗原反应性 ,以重组蛋白为抗原的ELISA法在特异性和敏感性方面优于以全病毒裂解液为抗原者。结论　重组SARS-CoV的N蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,可作为新一代SARS-CoV抗体检测试剂盒的备选抗原     

人类ZAKβ与YWHAZ蛋白相互作用的初步研究

目的研究ZAKβ与YWHAZ蛋白之间的相互作用。方法以ZAKβ为诱饵蛋白,利用酵母双杂交筛选人类肝脏cDNA文库,经GST Pull-down、免疫共沉淀和细胞共定位实验分别验证ZAKβ与猎物蛋白在体外和细胞内的相互作用,构建ZAKβ的截短体以确定相互作用的区域,用磷酸化抗体检测ZAKβ在相互作用中的磷酸化作用,并通过流式细胞仪检测这对蛋白相互作用对细胞周期的影响。结果利用酵母双杂交筛选到一个能与ZAKβ相互作用的蛋白YWHAZ,并在体外和细胞内都验证了这二者的相互作用,发现这两个蛋白都能共定位于293T细胞的胞质中,确定了ZAKβ的N端1~250氨基酸为与YWHAZ蛋白相互作用的区域。体外实验发现了这二者的相互作用涉及到磷酸化反应,发现这对蛋白的相互作用能提高293T细胞的G2期水平。结论首次发现并证实了ZAKβ和YWHAZ之间的相互作用,发现该相互作用涉及到磷酸化过程并能够对细胞周期产生影响。