空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC-a基因的克隆、原核表达及鉴定

目的:克隆甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因,构建原核表达系统并鉴定重组蛋白的抗原性。方法:PCR方法扩增fliC-a基因,克隆到质粒pET-42a构建原核表达载体pET-fliC-a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白rfliC-a表达,用SDS-PAGE鉴定rfliC-a,Western blot和双向免疫扩散法鉴定rfliC-a的抗原性和免疫原性。结果:成功表达并纯化获得相对分子量为14.4 kDa的重组蛋白rfliC-a,rfliC-a能与兔抗甲型副伤寒沙门菌全菌血清发生特异性结合,免疫家兔获得高效价抗体。结论:成功构建了fliC-a基因原核表达系统,所表达的rfliC-a具有良好的抗原性。     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

利用大肠埃希菌分泌表达乙型肝炎病毒核心抗原

目的:研究乙型肝炎病毒核心(C)基因在大肠埃希菌(E.coli)中的表达,以期获得分泌表达的具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg。方法:构建重组质粒pET-3c-cAg、pET-30a-cAg、pGEX-4T-1-cAg,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HBcAg。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因正确克隆到E.coli各表达载体中。ELISA和Western blot分析表明,以pET-3c和pET-30a为表达载体能在E.coli分泌表达HBcAg,而以pGEX-4T-1为载体只能胞内表达,其中以pET-3c为载体的分泌表达量最高,培养上清中其效价为1∶128;用分泌表达的HBcAg作为诊断抗原检测抗-HBc阴阳性血清及国家参考品,符合率为100%。结论:成功获得HBcAg在E.coli的分泌表达,且其具有较高的特异性和免疫反应性。     

HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

尿道致病性大肠杆菌fimA基因的克隆与表达

目的 对尿道致病性大肠杆菌(UPEC)132编码Ⅰ型菌毛的结构基因fimA进行克隆与表达,建立免疫学检测方法.方法 采用PCR方法扩增fimA基因,定向克隆pET32a载体,原核表达获得FimA重组蛋白;免疫小鼠制备FimA多克隆抗体;建立全菌ELISA方法,检测UPEC 132的Ⅰ型菌毛表型.结果 PCR扩增imA全基因,构建重组质粒pET32a-fimA,经转化构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a-fimA;经IPTG诱导表达及镍亲和层析纯化获得重组蛋白FimA;制备的FimA多克隆抗体效价≥1:51 200,Western blot显示其良好的特异性;全菌ELISA获得满意结果.结论 成功地克隆UPEC Ⅰ型菌毛的结构基因fimA,制备的多克隆抗体为UPEC的检测和致病性的研究奠定了基础.     

鹦鹉热嗜衣原体CPSIT-0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测

目的构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)CPSIT-0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性。方法采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT-0531基因,并构建pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT-0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT-0531蛋白的免疫原性。结果成功构建了pET30a-CPSIT-0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT-0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000。结论成功克隆表达了His-CPSIT-0531,该蛋白具有较好的免疫原性。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32_α(+),构建重组质粒pET32_α-Sj32,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET32_α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为55 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的23%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32_α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

miR-33b表达载体构建及表达活性检测

目的:构建miR-33b真核表达载体及其表达活性检测。方法:人工合成miR-33b成熟cDNA序列,以GV251为载体,构建miR-33b真核表达载体,并对重组克隆进行测序确保载体构建成功;采用脂质体转染法将miR-33b表达载体导入人胃癌细胞MKN-28中,通过倒置荧光显微镜观察转染效率,再利用实时定量RT-PCR检测miR-33b的表达,以检测外源基因的表达活性。结果:成功构建了miR-33b真核表达载体;转染细胞后采用倒置荧光显微镜观察表明载体中GFP的表达活性较好;实时定量RT-PCR结果表明,相较于对照组细胞,miR-33b转染组中miR-33b表达显著增加,且具有显著性差异(P0.05)。结论:成功构建miR-33b真核表达载体,并为进一步研究miR-33b参与胃癌发生发展机制奠定基础。     

构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原原核表达载体

目的 构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段的原核表达载体，为SARS的诊断和预防奠定基础。方法 采用人工合成法合成SARS病毒E2蛋白3’端cDNA；采用常规分子克隆方法将此cDNA片段克隆入原核表达载体pBV220中，经温度诱导和SDS-PAGE电泳证明外源蛋白表达。结果 合成的E2蛋白cDNA经序列测定表明，与报道的SARS病毒相应序列一致，内切酶酶切及PCR均得到456bp的cDNA片段，与实验设计一致，证明该cDNA片段插入了pBV220载体中；SDS-PAGE电泳表明有外源蛋白表达。结论 成功合成并克隆出SARS病毒E2蛋白原核表达载体。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。     

霍乱毒素B亚单位在乳酸乳球菌食品级表达系统中的分泌性表达

目的 在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)食品级分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ和L.lactis MBP71/pSQ中克隆表达霍乱毒素B亚单位(CTB),实现CTB的分泌性表达.方法 采用PCR扩增霍乱弧菌569B菌株染色体中CTB蛋白编码基因片段,克隆到食品级分泌表达载体pSQZ和pSQ中,转化入宿主菌L.lactis MBP71,构建CTB的分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB;采用Western-blot检测重组菌株中CTB的表达及表达量.结果 PCR扩增得到CTB编码基因片段ctB,酶切、连接到载体pSQZ和pSQ并转化到宿主菌L.lactis MBP71中,构建了分泌性表达系统L.lactis MBP71/pSQZ-ctB和L.lactis MBP71/pSQ-ctB.Western-blot检测发现,L.lactis MBP71/pSQ-ctB和L.lactis MBP71/pSQZ-ctB系统均能分泌性表达CTB,L.lactis MBP71/pSQ-ctB上清的表达量约为2 μg/ml;L.lactis MBP71/pSQ-ctB的表达效率远远高于L.lactis MBP71/pSQZ-ctB.结论 成功实现了CTB在食品级表达系统中的分泌性表达.     

细胞穿透肽CCL融合蛋白的构建与表达

目的评估细胞穿透肽CCL融合蛋白构建的可能性。方法将CCL6 PEP 6XHis构建至pABP质粒，然后提取pABP CCL6 PEP质粒进行人胚肾HEK293细胞转染表达，以及CCL6 PEP 6XHis 蛋白层析纯化和检测。结果成功构建并纯化细胞穿透肽CCL融合蛋白。将CCL6 PEP 6XHis Tag 基因经PCR扩增、接入T 载体、克隆、培养，并提取质粒进行测序鉴定，所得序列与目的基因一致。成功将CCL6 PEP 6XHis基因构建至哺乳动物细胞表达载体pABP 中，经质粒提取和酶切鉴定，电泳结果显示，HindⅢ + XbaⅠ切出约430 bp的条带，符合预期，酶切鉴定正确。蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果阳性，表明纯化得到的目标蛋白带有hisx6标签。结论细胞穿透肽CCL融合蛋白能够人工构建，并通过真核细胞进行表达。     

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a（＋）质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a（＋）-vacA转化大肠埃希菌,（IPTG）诱导表达后进行（SDS-PAGE）电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a（＋）-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a（＋）-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。     

阿魏蘑菇提取物对肿瘤细胞p53表达的影响

目的 探讨新疆阿魏蘑菇提取物对体外培养的肿瘤细胞p53蛋白表达的影响，从细胞凋亡角度研究其抗肿瘤机制。方法 采用肿瘤细胞体外培养技术及流式细胞技术，观察阿魏蘑菇不同剂量的水提物及醇提物对体外培养的4种肿瘤细胞p53蛋白表达的影响。结果 MTT实验结果显示，受试物对4种类型肿瘤细胞均具有较强的杀伤作用，尤其以0．1g／m1剂量组为明显；HT实验结果表明，经受试物处理后，4种类型肿瘤细胞均观察到细胞核固缩，DNA浓缩并向核膜靠拢形成浓染致密颗粒，并有典型凋亡小体出现。提示，受试物可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用；流式细胞仪检测结果显示，受试物处理后，4种类型肿瘤细胞p53蛋白表达水平均有不同程度的上调，尤其以醇提物作用24h后对Q3细胞p53蛋白表达水平的影响最为明显。结论 阿魏蘑菇提取物中的各组分可协同作用诱导肿瘤细胞促凋亡基因的表达，从而达到抗肿瘤的目的，有关阿魏蘑菇通过何种途径提高p53蛋白表达水平尚待深入探讨。