基因重组人红细胞生成素的临床应用现状

促红细胞生成素是一种能刺激红细胞增殖、分化及成熟的糖蛋白造血因子。基因存在人染色体7q~(11)～g~(22)区域。1983年分离和克隆出人体促红细胞生成素基因,随后应用基因工程技术,获得了大量促红细胞生成素纯品,称为基因重组人红细胞生成素(Recombinat human erythropoietin rHuEpo,简称EPO)。近年来,EPO除用于治疗肾性贫血外,在临床上的应用逐渐增多,收到了     

构建促红细胞生成素表达载体及其在肾小管上皮细胞中的表达

目的构建促红细胞生成素（EPO）表达质粒,并在人近端肾小管上皮细胞中稳定表达。方法应用标准分子克隆技术构建EPO真核表达载体pcDNA3.1（-）-hEPO。磷酸钙法转染人肾小管近端上皮细胞（HK-2）。酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养液上清中的EPO含量。MTT法绘制备组细胞生长曲线。结果构建获得EPO基因的表达质粒,并成功转染肾小管上皮细胞,后者经G418筛选,稳定表达EPO。转染后第21天,其表达量为同期转染的293细胞的（35.0±5.3）%。转染后HK-2细胞生长曲线未见明显改变。结论人近端肾小管上皮细胞可以稳定表达EPO,这为EPO基因治疗选择新靶点奠定了基础。     

促红细胞生成素与红细胞生成的调控

促红细胞生成素 (Epo)是特异性作用于红系祖细胞的糖蛋白激素。近年来 ,重组人Epo已研究成功并应用于临床 ,加速了对Epo的基础及应用研究。本文综述了Epo的基因、蛋白质结构及生物学特性、Epo的产生部位与生成的可能调节机制 ;Epo受体的分子结构及Epo与受体结合后的信号传递途径     

红细胞生成素生物功能及其介导的信号转导

红细胞生成素（erythropoietin,Epo)是肾脏产生的一种糖蛋白类激素,主要调控红系祖细胞的增殖、分化和存活。Epo基因3’端增强子调控缺氧诱导的Epo基因表达,缺氧诱导因子与该增强子结合后可启动Epo基因的表达。红细胞生成素受体（erythropoietin receptor,EpoR)p66为－Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于红系祖细胞的CFU－E阶段。蛋白质p85和p100与p66相偶联,参与受体结构的组成。Epo与EpoR结合后可导致后者的同源二聚化,激活与之组成型相结合的Jak2酪氨酸激酶,继而激活Ras/MAPK、3－PI激酶以及STAT等细胞内信号转导通路。     

促红细胞生成素小干扰RNA真核表达载体的构建

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)新靶点的小干扰RNA (siRNA)真核表达载体构建策略.方法 设计合成3个EPO siRNA片段,与含有绿色荧光蛋白和卡那霉素抗性的质粒载体连接,转化到JM109大肠埃希菌感受态细胞中,采用碱基序列测序方法鉴定其构建情况.在人脑神经胶质瘤U251细胞株中,转染成功构建的3个EPO siRNA真核表达载体,采用倒置荧光显微镜,观察U251细胞绿色荧光蛋白表达情况.结果 ①本研究成功构建了新靶点EPO siRNA真核表达载体,即PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3,并且构建的3个EPO siRNA真核表达载体序列,与所设计的标准序列完全相同,未发现任何突变、缺失、插入等基因异常情况.②本研究成功将3个EPO siRNA真核表达载体PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3转染至人脑神经胶质瘤U251细胞内,并且所有转染PEPO-1、PEPO-2与PEPO-3的U251细胞均表达绿色荧光蛋白.结论 本研究成功构建新靶点EPO siRNA真核表达载体,并将其转染于人脑神经胶质瘤细胞中,为EPO在贫血等疾病中的作用机制研究奠定了实验基础.     

促红细胞生成素与红细胞生成的调控

促红细胞生成素（Epo）是特异性作用于红细胞的糖蛋白激素。近年来,重组人Epo已研究成功就应用于临床,加速了对Epo的基础及应用研究。本文综述了Epo的基因、蛋白质结构及生物学特性、Epo的产生部位与生成的可能调节机制;Epo受体的分子结构及Epo与受体结合后的信号传递途径。     

红细胞生成素生物功能及其介导的信号转导

红细胞生成索(erythropoietin,Epo)是肾脏产生的一种糖蛋白类激素,主要调控红系祖细胞的增殖、分化和存活。Epo基因3’端增强子调控缺氧诱导的Epo基因表达,缺氧诱导因子与该增强子结合后可启动Epo基因的表达。红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EpoR)p66为-Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于红系祖细胞的CFU-E阶段。蛋白质p85和p100与p66相偶联,参与受体结构的组成。Epo与EpoR结合后可导致后者的同源二聚化,激活与之组成型相结合的Jak2酪氨酸激酶,继而激活Ras/MAPK、3-PI激酶以及STAT等细胞内信号转导通路。     

基因重组人红细胞生成素治疗各类贫血临床观察

基因重组人红细胞生成素治疗各类贫血临床观察金运松，鲍杨漪，夏云玲，夏秀芳，王祖贻（指导）瞿尔鑫（安徽省合肥市第一人民医院，合肥２３００６１安徽医科大学中国人民解放军第１０５医院）红细胞生成素（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｅｐｏ）是一种能刺激红系细胞...     

重组人白细胞介素-6(IL-6)受体基因导入大鼠髓性白血病细胞及基因表达

可移植性大鼠急性粒系白血病(Brown Norway rat acute myelocytic leukemia,BNML)是研究人急性粒系白血病的颇为完备的实验模型。由于重组人IL-6(rhIL-6)可作用于大鼠,然而大鼠BNML细胞系LT12缺乏rhIL-6受体(rhIL-6R)表达。为了在BNML模型探讨rhIL-6在体外以及体内对白血病细胞增殖和分化的影响,本文应用改良的磷酸钙共沉淀法将携带rhIL-6R cDNA的逆转录病毒表达质粒XM6/IL-6RNeo导入LT12细胞,经过G418筛选获得G418抗性克隆,建立了表达rhIL-6R的LT12亚细胞系(称之为R cell lines)。我们分别应用三种不同的方法(rhIL-6R的单克隆抗体和FACScan检测、~(125)I-rhIL-6的配基结合分析测定、地高辛配基标记的rhIL-6R cDNA探针的细胞原位杂交技术)分折了R细胞系在体外不同条件下传代过程中及给BN大鼠尾静脉回输后其rhIL-6R的表达。研究结果表明,用改良的磷酸钙共沉淀法将编码rhIL-6R cDNA和Neo~R基因的逆转录病毒表达质粒XM6/IL-6RNeo导入LT12细胞系后,受体细胞在体外含适当浓度G418的基质液中传代培养,可长期稳定表达rhIL-6R,给BN大鼠尾静脉回输后20天左右,其脾脏和骨髓细胞均可检测到rhIL-6R的明显表达,而且~3H-TdR掺入分析证明细胞膜表面所表达的rhIL-6R可以介导外源性rhIL-6信号传到细胞核内。     

人乳癌细胞小球藻CvFad3基因的表达和作用

目的构建真核表达载体pEGFP-C3-n-3,检测小球藻n-3脂肪酸脱氢酶基因CvFad3在人乳癌MCF-7细胞中的表达和作用。方法通过RT-PCR法扩增得到CvFad3基因,将CvFad3基因cDNA插入到真核表达载体pEGFP-C3中,构建重组表达载体pEGFP-C3-n-3,并将其转染入MCF-7细胞中,设空载体pEGFP-C3为对照组。采用RT-PCR检测CvFad3基因的表达,MTT法分析CvFad3基因对MCF-7细胞增殖的影响,气相色谱检测CvFad3基因对MCF-7细胞n-3多不饱和脂肪酸含量的影响。结果构建的重组载体pEGFP-C3-n-3转染入乳癌MCF-7细胞48 h后可检测到CvFad3基因mRNA的条带,而转染pEGFP-C3的MCF-7细胞48 h后检测不到CvFad3基因mRNA的条带。与对照组比较,转染pEGFP-C3-n-3的细胞MTT吸光度明显降低（t=6.039,P〈0.01）;人乳癌细胞MCF-7细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量显著升高。结论重组载体pEGFP-C3-n-3构建成功,CvFad3基因能在MCF-7细胞内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖,增加了细胞膜n-3多不饱和脂肪酸的含量。     

人IL-4真核细胞表达载体的构建与分析

本研究应用牛乳头瘤病毒质粒(BPV-1)构建了一个表达载体pdBHhIL—4。该载体应用SV40启动子,可以有效地启动外源基因的表达,保留了BPV-1的氨基苄青霉素抗性(Amp~R)基因作为筛选标志,经限制性内切酶和Southern杂交分折提示构建是成功的,新的载体不仅促进了IL—4转化和表达,也为其它真核基因在真核细胞的表达提供了工具。     

逆转录病毒载体介导Neo~R基因转入正常人造血祖细胞

本文应用逆转录病毒载体介导基因转移法将含有新霉素抗性(neo~R)基因的双拷贝逆转录病毒载体pN2A转入正常人造血祖细胞。应用Ficoll分层液(比重1.064)富集人造血干、祖细胞,预培养后与已经照射的生产重组病毒包装细胞株共同培养24小时,经含G418(1000μg/ml)体外半固体培养,可见具有抗性的CFU-GM集落生长。应用PCR方法检测转染细胞中neo~R基因的转移和表达,在生产逆转录病毒的辅助细胞株PA317/N2及体外液体培养的骨髓细胞中均可扩增出neo~R基因的DNA片段,进一步证实了neo~R基因在正常人造血干、祖细胞的有效转移和表达。     

携带IL-18基因人脐带间充质干细胞的构建

目的构建携带白细胞介素-18（IL-18）基因人脐带间充质干细胞（hUMSCs）,为肿瘤靶向性基因治疗研究提供工具。方法体外分离培养hUMSCs,流式细胞仪（FACS）检测hUMSCs细胞免疫表型。应用基因重组技术将表达IL-18基因的慢病毒转染至hUMSCs,利用RT-PCR及Western方法检测IL-1蛋白及mRNA表达水平。结果成功在体外分离和培养了hUMSCs,FACS检测结果显示,hUMSCs表达CD29、CD44和CD105,而不表达CD34和CD45,符合hUMSCs的表型。成功构建携带IL-18基因的hUMSCs,RT-PCR及Western方法检测结果显示,IL-18基因转染至hUMSCs并能稳定表达。结论构建了携带IL-18基因的hUMSCs并稳定表达IL-18,为肿瘤靶向性基因治疗实验性研究提供了一种新的实验工具。     

小鼠T淋巴细胞MHCI类抗原基因转染和表达的检测

方法 :采用基因转移技术在体外将供体鼠MHCI类抗原H -2KbcDNA基因转染受体鼠T淋巴细胞 ,回输受体胸腺 ,诱导对供体的特异性耐受。对体外转染的受体鼠T淋巴细胞进行了基因整合和表达的检测。结果 :PCR扩增H -2KbcDNA ,证实目的基因已整合到染色体DNA上。取转染后 72h的T细胞 ,用抗H -2Kb 单克隆抗体荧光染色作流式细胞仪检测 ,证实在转染靶细胞膜上有H -2Kb 抗原表达 ,转染率为 46 2 %     

人白细胞介素3基因克隆、表达及产物的功能研究

人白细胞介素3(IL-3)作用于早期造血并具有广谱效应。为了制备足量高纯度的IL-3,本研究利用分子遗传学技术构建了三株重组IL-3表达菌株,其中一株表达水平为16％。菌体裂解物对人粒-巨噬系祖细胞有刺激增生的作用;对小鼠早期与晚期红系祖细胞亦有刺激作用,对晚期的作用强;但是对小鼠粒-巨噬系祖细胞无刺激作用,提示人IL-3的造血刺激作用可能具有种属特异性。     

乳腺癌组织中雌激素受体与C-erbB-2基因、多药耐药基因MDR1表达

目的观察乳腺癌组织中雌激素受体(ER)与C-erbB-2基因、多药耐药基因MDR1(P-gp)蛋白表达并探讨其相互关系。方法用免疫组织化学法(S-P法)对162例乳腺癌手术切除标本进行ER、C-erbB-2、MDR1(P-gp)检测,结果作统计学分析。结果ER、C-erbB-2、MDR1(P-gp)的阳性表达率各为53.7%、37.0%和27.7%。ER在分化越高和无腋窝淋巴结转移者的乳腺癌中其阳性表达率高,C-erbB-2在分化越差的乳腺癌中其阳性表达率高,组间相比有显著差异(P<0.05)。在有腋窝淋巴结转移的乳腺癌中C-erbB-2、MDR1(P-gp)表达率明显升高。C-erbB-2与MDR1(P-gp)的阳性表达率间具有一定的正相关性,C-erbB-2表达与ER表达呈负相关。结论ER、C-erbB-2基因、MDR1(P-gp)在乳腺癌中有一定的内在联系,联合检测有助于乳腺癌预后的判断,为合理制定综合治疗方案提供依据。     

人CD34抗原基因在痘苗病毒系统中的表达

从ｐＵＣ１８－３４重组质粒双酶切分离得到编码人ＣＤ＿（３４）抗原的全长ｃＤＮＡ片段，将此基因插入痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了重组质粒ＮＳＡ１１７５－３４。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，将质粒ｐＪＳＡ１１７５－３４导入已被野生痘苗病毒感染的ＴＫ￣－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人ＣＤ＿（３４）抗原基因的重组痘苗病毒。经活细胞免疫荧光（ＩＦＡ）和碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶（ＡＰＡＡＰ）检测表明，重组痘苗病毒能够特异地表达人ＣＤ＿（３４）抗原。人ＣＤ＿（３４）抗原基因的表达，为探讨ＣＤ＿（３４）抗原结构和功能以及研制ＣＤ＿（３４）单克隆抗体奠定了基础。     

粒-巨噬系集落刺激因子基因在大肠杆菌中的高效表达

粗-巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)是一种重要的造血生长因子,主要是刺激粒细胞和巨噬细胞大量增殖。其临床疗效显著而且副作用小。本文先从正常人外周血细胞中提取总RNA,经逆转录——PCR扩增克隆了GM-CSF之cDNA。以DNA序列分析证实与文献一致。再设计合成一对引物定向改造编码成熟GM-CSF基因的5′端:换成大肠杆菌偏性密码,并避免起始点周围形成强二级结构,把终止密码子换成TAA。将改造后的基因克隆到载体pBV220中,转化受体菌HB101,经42℃诱导高效表达出GM-CSF。表达产物约占全菌蛋白的20％,初步纯化和复性后比活性>1×10~7U/mg。