仿生组装纳米羟基磷灰石/壳聚糖骨修复材料的制备及其生物相容性研究

目的 探讨以一种简单、廉价的方法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HA/CS)复合材料,并评价其理化特征和生物相容性. 方法采用原位沉析和冷冻干燥法制备n-HA/CS支架,通过扫描电镜、组织切片染色、X线衍射和傅立叶红外光谱分析其微观形貌和组成;采用万能材料试验机分析材料的力学性能.采用材料浸提液和表面接种考察n-HA/CS复合材料对第3代人骨髓基质干细胞(hBMSCs)黏附、增殖的影响,评估其细胞相容性.将n-HA/CS复合材料植入新西兰大白兔背部肌袋,经组织学染色后评价其组织相容性. 结果 n-HA/CS复合材料具有多孔结构,孔隙率为(88.65±2.34)%,孔径为(112.63±20.47) μm,HA晶体颗粒长度为200～700 nm,且分散均匀;X线衍射和红外光谱分析表明合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体.材料的断裂强度为(1.47±0.15)MPa,弹性模量为(37.52±3.43)kPa,可满足非负重部位骨修复要求.n-HA/CS材料浸提液未明显抑制hBMSCs的增殖,直接接种在n-HA/CS复合材料表面的细胞黏附、增殖功能正常;组织相容性实验也表明,植入4周后组织炎性反应明显减轻,12周后材料基本降解并由新生组织爬行替代. 结论采用原位沉析和冷冻干燥法制备的n-HA/CS复合材料具有良好的理化性质和生物相容性,有望应用于组织工程骨的构建.     

纳米羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架的研究

目的以一种简单、有效的方法制备多孔的纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatite,nano-HA)-壳聚糖(chitosan,CS)复合支架,并评价其理化性能及与细胞相容性。方法采用原位复合-冷冻干燥方法,制备多孔nano-HA-CS支架。通过扫描电镜、透射电镜、X线衍射和傅立叶红外光谱分析支架的微观形貌及材料的组成。分离初生Wistar大鼠的成骨细胞,取传代培养第3代细胞分别与nano-HA-CS支架和纯CS支架共培养2、4、6、8h,各时间点各取4个样品,测定细胞在支架上的黏附率,并通过组织化学染色、扫描电镜观察细胞形态。结果nano-HA-CS复合支架具有多孔结构,孔径为100~500μm,大多数孔径为400~500μm。具有很高的孔隙率,随CS和HA含量的增加,孔隙率明显降低,密度升高。扫描电镜和透射电镜观察显示合成的HA晶体,晶粒大小为纳米级,在支架孔壁上均匀、连续分布如“铺路石”样。X线衍射和红外光谱分析表明合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体。细胞相容性实验显示,成骨细胞在支架上黏附、增殖,并分泌纤维状细胞外基质;在复合支架上的黏附率明显高于纯CS支架。结论采用原位复合与冷冻干燥法结合制备的nano-HA-CS复合支架具有良好的理化性质和细胞相容性,有望应用于组织工程骨的构建。     

胶原/羟基磷灰石骨软骨一体化支架的生物学特性研究

[目的]对体外条件下胶原/羟基磷灰石一体化复合材料的生物学特性进行评价,探讨其作为骨软骨组织工程支架的可行性。[方法]以胶原和羟基磷灰石为原料,研制出由胶原逐层过渡到羟基磷灰石为主的一体化支架材料,其软骨层主要成分为胶原,骨层主要成分为羟基磷灰石。通过扫描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率。将材料与兔骨髓基质细胞复合培养,MTT法测定细胞的生长曲线,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况。[结果]胶原/羟基磷灰石一体化复合支架具有疏松多孔结构,其中软骨层孔径大小(90±15)μm,骨层孔径大小(120±20)μm,孔隙率(75±5.0)%。细胞在材料上生长良好。[结论]胶原/羟基磷灰石一体化复合材料具有适宜的孔隙结构和良好的生物相容性,可用作骨软骨组织工程支架材料。     

明胶/纳米羟基磷灰石三维多孔骨支架的制备及其生物安全性评价

[目的]探讨冷冻干燥法制备明胶/纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)三维多孔支架的可行性并评价材料的生物安全性。[方法]取明胶水溶液,将其分别与10 wt%、20 wt%、30 wt%的nHA混合,交联后采用冷冻干燥法制备明胶/nHA三维多孔支架。评价材料的理化性质,通过测定支架孔径、孔隙率、吸水率、抗压强度及降解pH值优化制备条件;MTT法分析支架浸提液毒性;共培养观察细胞在材料表面及周围生长情况;材料埋入背部肌肉内,组织学染色观察评价其生物安全性。[结果]体视显微镜及电镜显示,制备的支架均呈三维多孔隙结构。随着nHA含量的增加,材料成孔效果变差,孔径、孔隙率、吸水率变小,而抗压强度增加。其中以nHA含量为20 wt%的材料表现更为适宜,并选其进行生物相容性实验。MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞与材料共培养生长状态良好。HE染色观察材料与周围肌肉组织无排斥反应,组织相容性良好。[结论]制备的明胶/nHA支架材料具有三维孔隙结构,具备合适的孔径和孔隙率,无毒,生物相容性良好,可作为骨组织工程支架使用。     

柱状分层的胶原-羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞体外培养

目的 观察具有柱状分层结构的胶原-羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）复合支架对软骨细胞的吸附作用及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性及价值。方法 以胶原复合HA逐层制备胶原-HA复合支架，体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原-HA复合支架材料上进行三维立体培养3周，通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果 胶原-HA复合支架为柱状，支架表层为胶原。平均孔径为147μm，孔隙率89％；中层为多孔胶原-HA复合；底层为HA，平均孔径为85μm，孔隙率85％。胶原-HA复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面24h后，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌细胞外基质，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论 具有柱状分层结构的胶原-HA复合支架其细胞相容性良好，较胶原纤维具有更强的力学性能，有望成为一种比较理想的软骨组织工程支架材料。     

骨骺干细胞复合壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)经诱导后向软骨细胞方向分化的性能,及其与壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性.方法 用显微手术器械剪取新生24 h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的La Croix环处组织,应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs,免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3(FGFR-3)的表达情况.体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化,免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况.以诱导后接种于CS/nHA支架培养的PSCs为实验组,以诱导后未接种支架的细胞为对照组.扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变,MTT法检测细胞增殖情况,阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖(GAG)情况.对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较.结果 免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速,免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达.诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均旱阳性.细胞接种CS/nHA支架后1、4 d,实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义(P>0.05),而7 d实验组与对照组吸光度值比较筹异有统计学意义(t=-2.786,P=0.024).培养14 d后培养液GAG含量为(89.66±6.52)μg/106个细胞,高于对照组[(78.62±4.63)μg/106个细胞)],差异有统计学意义(t=-3.084,P<0.05).结论 免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化,诱导后的PSCs与CS/nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨.     

聚氨基酸复合纳米羟基磷灰石的体内生物相容性实验研究

[目的]评价新型生物材料聚氨基酸复合纳米羟基磷灰石(n-HA/MACP)在体内肌组织内和骨组织内的生物相容性.[方法]取新西兰大白兔18只,每只动物同时建立背部皮下肌袋材料埋置及单侧挠骨骨缺损材料植人两个模型,分别于2,4,8周,3个时间点分批每次处死6只实验动物取材,背部肌袋处行组织学HE染色及酶组织化学染色,挠骨缺损处行HE染色及改良Masson三色法特殊染色,并抽血行肝肾功检测与术前对比.[结果]肌组织标本HE染色结果显示4周后组织反应消失,未见炎性细胞,酶组织化学结果显示材料对酶活性无影响.骨组织标本HE染色及改良Masson三色法特殊染色检测结果显示材料与骨缺损界面结合紧密,未产生排斥反应,并诱导大量的软细胞分化,8周后开始出现新生骨小梁.肝肾功检测结果显示材料植人动物体内,术前与术后比较差异无显著性意义.[结论)聚氨基酸复合纳米羚基磷灰石具有良好的生物体内相容性,并且具有骨诱导性,是一种安全、无毒、表面微降解的生物材料.     

仿生增强型纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架研究现状

骨组织工程是修复骨缺损最有前途的方法,寻找理想的支架材料是目前骨组织工程研究的热点之一。近年来采用仿生学原理制备的增强型纳米羟基磷灰石聚乳酸复合支架材料因具有良好的生物相容性和生物降解性而广泛研究。该文就纳米羟基磷灰石-聚乳酸复合支架材料的制备、力学性能及影响因素、与骨髓间充质干细胞复合构建组织工程化骨、与骨形态发生蛋白复合构建活性人工骨的成骨性能研究现状作一简要综述。     

壳聚糖/羟基磷灰石支架修复骨软骨缺损的实验研究

[目的] 探讨双层壳聚糖(chitosan CS)/羟基磷灰石复合支架(hydroxyapatite HA)修复兔骨软骨缺损的可行性.[方法] 采用冻干法和烧结法制作双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架,以骨髓间充质干细胞为种子细胞,运用纤维蛋白胶种植技术,以双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架为载体,修复骨软骨缺损,实验分3组,A组:BMSc 支架,B组:单纯支架,C组:未处理.将修复材料植入骨软骨缺损模型,分别于6、12周取材,进行大体观察,组织学检测,改良Wakitani法评分,经统计学处理,比较各组修复效果差异(P＜0.05).[结果] (1)CS/HA支架CS层孔隙率为76%± 5.01%,孔径为200～400 μm,平均为300 μm左右,孔相通性好,HA层孔隙率为72%± 4.23%,孔径为200～500 μm,平均为350 μm左右,孔相通性好,结合部结合好;(2)P2骨髓间充质干细胞较纯,扫描电镜观察MSCs附着在复合支架上.大体观察和组织学检测显示, A组基本修复软骨缺损,骨缺损有骨小梁长入.B、C组骨软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维性组织或无新生组织形成,软骨及骨缺损均明显存在,改良Wakitani评分显示A组在6周、12周2个时间点的各项评分结果,均优于B、C组,且差异有统计学意义(P＜0.05).[结论] 双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架可作为骨软骨组织工程支架,结合BMSc可修复软骨与骨的缺损,重建关节的解剖结构和功能.     

天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料骨相容性研究(一)

目的：观察天然羟基磷灰石（Hydroxyaptitc HA）／壳聚糖（chitosan）复合材料（NHC）的骨组织相容性及与骨发生结合的界面情况。方法：将天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料植入兔颅骨中，用CT、三维CT和扫描电镜进行组织形态学方面的观察研究。结果：NHC植入后，植入体周围逐渐形成新骨，胶原成分逐渐成熟并减少。6个月时NHC于周围骨大部分发生融合，10个月时NHC与宿主骨发生牢固结合，成一骨性整体。结论：NHC有良好的骨组织相容性，能与骨发生骨整合。     

关节软骨组织工程支架的研究进展

目的对软骨组织工程支架材料的研究现状进行综述,并对其发展前景进行展望。方法广泛查阅近年来关节软骨组织工程支架的相关文献,并对多种天然生物支架材料和人工合成支架材料的相关实验及临床应用效果进行分析总结。结果软骨组织工程支架的设计对软骨组织损伤修复成功与否至关重要,理想的软骨支架可以引导并促进新生软骨组织的形成。目前所应用的支架材料均有其局限性。结论进一步深入研究软骨组织工程支架,对未来临床软骨损伤的修复具有重要意义。     

新型生物可降解材料与骨髓间充质干细胞生物相容性研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)与第3代聚羟基烷酸酯(PHA)类聚酯:3-羟基丁酸、3-羟基己酸无规嵌段共聚物[p(3HB-co-3HH)]的生物相容性,以及材料植入体内的组织相容性. 方法将培养的人MSCs分别接种于细胞载体p(3HB-co-3HH)上,通过相差显微镜和电镜,以及HE、Von Kossa染色和Ⅰ型胶原表达等分析,了解细胞载体复合物体外立体培养2周、或裸鼠体内植入后经过培养的MSCs在支架材料上生长、扩增和分泌基质等与材料的相容性. 结果 p(3HB-co-3HH)具有良好的亲水性及细胞亲和力,材料表面不需特殊处理(如卵磷脂、多聚赖氨酸包埋等),可以作为种子细胞的载体,接种的MSCs能够在材料中均匀分布,贴壁生长良好,维持骨髓干细胞表型.在培养体系中加入成骨诱导分化试剂后,贴壁生长的MSCs可向成骨细胞分化并分泌基质,表达Ⅰ型胶原. 结论 p(3HB-co-3HH)具有良好的生物相容性和细胞亲和性,是较好的可降解的高分子生物材料.     

聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物网管支架体外预血管化及体内植入的实验研究

目的研究预血管化对含网管的多孔可降解聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(polylacticl/glycolicacidcopolymer,PLGA)支架血管化的影响。方法将含网管的多孔可降解PLGA支架由小鼠微血管内皮细胞预血管化,分为体外预血管化组(A组)和单纯支架组(B组)。将两组支架植入12只雌性NIH小鼠肠系膜间,分别于术后2、4周取材,行组织学及免疫组织化学观察血管化情况,并应用图像分析软件计算支架血管化面积。结果支架体外预血管化后,其网管内可见微血管内皮细胞均匀贴壁。支架植入体内2周,切片血管化面积A组为2260.91±242.35μm2与B组823.64±81.29μm2比较,差异有统计学意义(P<0.01);4周时A组为17284.36±72.67μm2与B组17041.14±81.51μm2比较,差异无统计学意义(P>0.05)。植入2周支架切片肌动蛋白阳性染色面积A组为565.22±60.58μm2与B组205.91±16.25μm2比较,差异有统计学意义(P<0.01);4周时A组为4321.09±19.82μm2与B组4260.28±27.17μm2比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论含网管的多孔可降解PLGA支架是一种良好的简易血管化支架模型;预血管化可以明显增强支架植入早期的血管化。     

鼠胚胎肝细胞在体外L-聚乳酸支架上的长期培养及其成熟化诱导

目的 研究三维生物降解材料L—聚乳酸(PLLA)对胚胎肝细胞的支持作用及制瘤素M(OSM)、尼克酰胺(NA)和二甲亚砜(DMSO)在胚胎肝细胞成熟化中的作用，探讨胚胎肝细胞在肝脏组织工程中应用的可行性。方法 将两步法分离获得的E14．5—C57BL／6 CrSlc小鼠胚胎肝细胞接种于具有三维立体多孔结构的PLLA支架后，在含有及不合有OSM、NA和DMSO的Williams’E条件培养基中进行原代长期培养，了解其增殖能力、形态及功能变化。结果 与单层培养相比，三维立体PLLA支架培养胚胎肝细胞其细胞数量与白蛋白的分泌量均明显增加；单层培养中，单独添加OSM组白蛋白分泌仅有轻微增加，但PLLA培养中OSM组的胚胎肝细胞白蛋白分泌量明显增加；无论是单层培养或PLLA培养，OSM／NA／DMSO组白蛋白分泌均明显增加。结论 三维PLLA支架是胚胎肝细胞培养的良好支持物；OSM、NA和DMSO可明显促进肝脏实质细胞在体外的成熟。     

珍珠层聚乳酸人工骨复合成骨细胞体内异位成骨研究

目的探讨珍珠层聚乳酸(nacre／polylactic acid，N／P)人工骨与同种异体成骨细胞复合，植入体内后异位成骨的作用机制，以及作为骨组织工程支架材料的可行性。方法成年雄性新西兰大白兔18只，按2、4和8周3个时间点随机分成3组，每组6只。将体外培养的同种异体新西兰大白兔成骨细胞，种植到N／P人工骨材料上，并植入每只兔左侧背部皮下为实验组；以不复合成骨细胞的N／P人工骨材料植入右侧背部皮下作对照，分别于植入后不同时间点取材，经大体观察、组织学检查和免疫组织化学方法检测。结果实验组2周时材料周围有少许炎性细胞聚集，4周时有类骨质形成，8周时有成熟骨组织形成，其中可见骨髓腔；对照组2、4周时仅见大量纤维组织长入材料内，8周时材料内纤维组织增多，但无成骨发生。结论N／P人工骨可作为理想的骨组织工程支架材料。     

可生物降解止血粉的制备及其止血性能

目的采用壳聚糖(chitosan,CTS)为主要材料制备一种可生物降解止血粉并观察其止血性能。方法以可降解的天然有机高分子材料CTS为主材,海藻酸钠(alginate,ALG)为辅料,通过乳化交联工艺,制成一种结构疏松的微球。利用单颗粒光学传感技术测定微球粒径,扫描电镜观察干燥微球的超微结构,将其置于伤口渗出液中浸泡,分别于1、3、5、10、20、30和60min后测定微球溶胀率。以云南白药为对照,在6只新西兰兔的脾出血模型,随机使用CTS/ALG微球和云南白药进行止血,观察止血效果。结果乳化交联法工艺稳定,CTS/ALG微球形态圆整,粒度均匀,粒径为2～20μm,平均粒径为4.05±2.55μm。干燥态CTS/ALG微球呈白色粉体状,结构疏松,扫描电镜下可见其呈珊瑚状外观,表面布满皱折。CTS/ALG微球的溶胀率,5min时达280.139%。在兔的脾出血模型上CTS/ALG微球组的出血时间为2.83±0.17min,云南白药组为5.33±0.49min,止血效果明显优于云南白药组(P<0.01)。结论以CTS和ALG为材料制备的CTS/ALG微球止血性能良好,使用方便,是一种新型的粉体止血剂。