重组质粒pEGFP-ING4的构建及其对MCF-7细胞凋亡的影响

目的检测ING4(inhibitor of growth 4)对MCF-7细胞凋亡的影响。方法从人胎盘总RNA中克隆人ING4基因,构建其真核表达质粒pEGFP-ING4转染MCF-7细胞表达ING4后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光定量RT-PCR检测ING4、NF-κB、caspase-3、IL-8、Bcl-2及Bax基因的表达。结果构建的重组质粒转染可见目的蛋白融合表达,与对照相比MCF-7细胞凋亡率增高;ING4、caspase-3及IL-8基因的表达上调,NF-κB与Bcl-2/Bax基因的表达下调。结论成功从人胎盘组织克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达;ING4在人MCF-7细胞中能引起凋亡相关基因的改变并促进MCF-7细胞的凋亡,这为进一步研究ING4的抗肿瘤机制奠定了基础。     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

问号状赖型钩端螺旋体LAg42膜蛋白基因的克隆及真核表达研究

目的:构建赖型钩端螺旋体lag42基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞,为进一步研究奠定基础。方法:分别以问号状赖型钩体017株,56601株及双曲钩体PatocI株基因组为模板PCR扩增目的基因。构建lag42基因与质粒pcDNA3.1A 的重组真核表达质粒,克隆筛选并测序;通过脂质体介导将重组质粒转染入COS7细胞,用RT-PCR检测转染结果。结果:不同毒力赖型钩体均能扩增出约1100 bp的片段,而PatocI株则未能扩增出目的片段;PCR、双酶切及测序证实pcDNA3.1A -lag42构建成功;经RT-PCR检测证实重组质粒转染成功。结论:赖型钩体具有编码LAg42膜蛋白的基因,构建完成真核表达载体pcD-NA3.1A -lag42,并成功转染COS7细胞。     

人IL-6受体胞外区真核表达载体的构建及体外表达

目的 构建人IL-6受体(IL-6R)胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达.方法 利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3.1(+)中,用双酶切、测序鉴定.重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达.结果 PCR扩增出1 218 bp的目的 片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确.Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的 蛋白.结论 成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达.     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4 cDNA全长真核表达载体的构建及其在16HBE细胞中的表达

目的克隆人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因cDNA,构建其真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,并转染16HBE细胞。方法根据GeneBank中人TIM-4 cDNA序列(编号:NM-138379.2),设计出带有EcoRI和BamHI的上下游引物,应用RT-PCR技术,从人骨髓中扩增出TIM-4基因编码区序列,克隆到pMD18-T载体,形成pMD18-T-TIM-4重组质粒,经菌落PCR,双酶切,测序鉴定获得人TIM-4基因cDNA片段,然后将其亚克隆入pEGFP-C2绿色荧光载体中,并通过菌落PCR,双酶切,测序鉴定其重组体。将测序正确的pEGFP-C2-TIM-4质粒转染人气道上皮细胞(16HBE),用实时定量PCR检测目的基因的表达。结果成功扩增出人TIM-4 cDNA全长1134 bp,经T-A克隆构建的pMD18-T-TIM-4重组质粒经菌落PCR,双酶切,测序证实载体中含有正确的TIM-4编码区片段。由此构建的真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,经菌落PCR扩增出1134 bp左右的片段,经双酶切后产生4.7 kb和1134 bp左右的2条带,DNA测序显示与GeneBan...     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响

目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

ING4基因的克隆及其诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

 目的：分离小鼠ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 观察ING4基因转染人宫颈癌HeLa细胞后对细胞凋亡的影响。方法:应用RT-PCR技术从小鼠肝组织中扩增得到ING4cDNA。利用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4并用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,然后利用阳离子脂质体lipofectamine将其转染HeLa细胞，用RT-PCR检测ING4基因的表达情况，应用荧光显微镜（Hoechst33258染色）、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约 750 bp 的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.0-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现 750 bp 大小的条带，基因测序正确, Hoechst33258染色发现pcDNA3.0-ING4转染HeLa细胞的凋亡率（21.25%）明显高于对照组pcDNA3.0转染HeLa细胞的凋亡率（8.91%,P<0.01）。共聚焦显微镜也观察到了典型的细胞凋亡。细胞周期检测显示S期细胞所占百分数pcDNA3.0-ING4转染组高于pcDNA3.0转染组。结论:分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 初步研究发现该基因转染HeLa细胞后可促使细胞凋亡。     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

人CD81的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 从人外周血淋巴细胞中克隆出CD81基因，构建真核表达质粒，并在COS－7细胞中进行表达。方法 分离外周血淋巴细胞，提取细胞总RNA，采用RT－PCR扩增CD81基因。将CD81基因克隆至载体pcDNA3.1( )中，进行酶切及测序鉴定。以质粒pcDNA3.1-CD81转染COS－7细胞进行瞬时表达，并用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测蛋白的表达。结果 RT－PCR产物已插入载体pcDNA3.1( )构建成真核表达质粒pcDNA3.1-CD81。经双酶切和测序鉴定表明，克隆出的人CD81全长编码序列同GenBank收录的序列一致，并且真核表达质粒的构建正确。以脂质体转染COS－7细胞后，用免疫细胞化学染色法和流式细胞术检测表明，细胞可表达人CD81。结论 成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-CD81，为进一步研究HCV和CD81的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型打下了基础。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达

目的： 克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法：从人肝组织中提取总RNA,行RT-PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果：NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs-NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT-PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4 mRNA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论：NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。     

紫杉醇调节TIMP-1启动子活性及TIMP-1降低紫杉醇对乳腺癌细胞增殖抑制作用的研究

目的探讨TIMP-1在降低MCF-7对紫杉醇敏感性中的作用。方法采用DNA重组技术构建含timp-1基因启动子的荧光素酶报告质粒并瞬时转染MCF-7细胞,在撤血清条件下测定荧光素酶的相对活性,以验证重组质粒的有效性;重组质粒瞬时转染入MCF-7细胞中,经紫杉醇处理后,测定荧光素酶的相对表达活性;检测在紫杉醇作用下,TIMP-1过表达克隆与对照克隆细胞增殖的情况。结果酶切、PCR及测序鉴定结果证实成功构建带有TIMP-1启动子的报告基因表达质粒;且撤血清条件下TIMP-1启动子转录活性显著增强,1000nmol/L紫杉醇处理的MCF-7细胞中TIMP-1启动子调控的荧光素酶活性显著降低;紫杉醇对TIMP-1过表达克隆的细胞增殖抑制作用显著低于对照克隆。结论成功地构建了含timp-1基因启动子的荧光素酶报告质粒,准确地评价TIMP-1启动子在紫杉醇作用过程中的活性变化,并进一步阐明TIMP-1在降低乳腺癌细胞对紫杉醇敏感性中的作用。     

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的 构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以pcDNA3.1-flaghERα仅重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hER α全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利...     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。