中国人粘多糖贮积症Ⅰ型IDUA基因突变的检测

[目的]检测中国人粘多糖贮积症Ⅰ型患者IDUA基因(IDUA)突变.[方法]采用PCR-SSCP、PCR产物直接测序等技术对35例粘多糖贮积症Ⅰ型患者的IDUA第2、6、7、8、9和10外显子及其相邻区域进行突变筛查.[结果]本研究筛查出7种突变,均为单碱基置换.一内含子区突变nt1486C→T;一中性突变nt1945G→C;1种无义突变E404X;4种错义突变F198L、L218V、A361T和V454I.[结论]中国人IDUA在第2、6、7、8、9和10外显子区存在突变.在上述检测到的7种突变中,A361T国外已确定为多态性,E404X国外已报道为重型突变.而nt1486C→T、F198L和L218V和V454I为我们首次发现和报道,可能为新突变,但其突变性质还有待于进一步鉴定.     

利用体外定点诱变技术构建人突变型α—L—艾杜糖醛酸酶基因

目的：构建突变型α－L－艾杜糖醛酸酶基因（IDUA）cDNA，为体外表达，鉴定突变的性质提供物质基础。方法：以野生型pcDNA3-IDUA为基础质粒，采用双引物法体外定点诱变技术，引入突变E404X。结果：突变区域经PCR－SSCP和测序证实诱导突变成功。结论：本研究成功构建了突变型IDUA cDNA，可用于下游的体外表达，此定点突变技术具有简便，诱变效率高等优点，是体外构建突变型基因的一种有效方法。     

Hepatitis B virus S gene mutants in infants infected despite immunoprophylaxis

Objective　To assess the correlation between hepatitis B virus (HBV) surface gene mutant infection and hepatitis B (HB) vaccination failure. Methods　Using sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and failed in HB immunoprophylaxis, HBV S gene was amplified by PCR, transferred to nylon membranes for Southern blots, and then hybridized with oligonucleotide probes. Eleven of non-hybridizing samples were used for DNA sequencing. Results　93.4% (99/106) of the samples were HBV DNA positive, and 30.3% (30/99) failed to hybridize with at least one of the four probes. DNA sequencing confirmed that 10 of the 11 samples had an S gene mutation with amino acid (aa) change. The identified mutants included nucleotide (nt) 546T→A(aa131N→T), nt531T→C (aa126I→T), nt491A→C (aa113T→P), nt491T→A (aa113S→T), nt533C→A (aa127P→T), nt581T→A (aa143S→T), nt636A→T (aa161Y→F), and nt679A→C (aa175L→F). The sequence in one mother-infant pair was completely the same, with mutations at aa131 and aa161. Conclusions　The prevalence of HBV surface mutants is about 30% in the children failing in HB vaccination. HBV mutants can infect infants by maternal-infant transmission.     

乙型肝炎病毒adr型全基因组C区突变株的构建及其生物学活性检测

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因组C区L97和V60突变质粒，并检测其生物学活性。方法 采用定点突变技术将HBVadr1．2拷贝基因组质粒p3．8Ⅱ进行C区点突变，构建L97和V60两个突变株。质粒经脂质体介导转染HepG2细胞，Southern杂交分析细胞内HBVDNA复制，ELISA检测培养上清中HBsAg和HBeAg。结果 测序结果表明所构建的突变质粒p3．8L97和p3．8V60分别为nt2189A→C和nt2086→G，突变质粒均可在宿主细胞内复制和表达。结论 所构建HBV（adr型）全基因组C区L97和V60突变质粒具有生物活性。     

7个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析

目的：对7个肾上腺脑白质营养不良家系进行基因突变分析。方法：应用RT—PCR技术。对7个患者的ABCD1基因编码区，分4个片段进行扩增并对PCR产物直接测序。应用PCR-限制性酶切或DNA测序等方法分析相应的基因组DNA,进一步确证ABCD1的突变位点。结果：在7名肾上腺脑白质营养不良患者的ABCD1基因上，存在6个不同的碱基置换（709C〉A、807G〉A、1161C〉T、2065C〉T、2113T〉C和2235C〉T）、1个碱基缺失（1801delAG）和1个碱基插入（1126insGCCATCG），分别造成5个错义突变（A141T、R259W、P560L、L576P和R617C）、2个移码突变（fs I246和fs E471）和1个无义突变（S108X）。结论：在中国人肾上腺脑白质营养不良患者中发现4个新的ABCD1基因突变。即S108X、fs I246、R259W和L576P突变。不同家系具有不同的突变位点，且突变类型和表型之间无特殊的相关性。     

女性血友病A FⅧ基因的双重杂合突变-1例基因分析

目的对1例女性血友病A(HA)患者家系进行基因分析，以探讨其分子发病机制。方法FⅧ：C等测定进行HA表型诊断；用LD—PCR进行内含子22倒位检测，对FⅧ基因的所有外显子及其侧翼序列进行扩增，用末端标记双脱氧法检测核酸序列。结果表型检测先证者(父亲)及其女儿的FⅧ：C分别为6．9％、3．4％；3人内含子22倒位为阴性；先证者女儿FⅧ14号外显子存在自发杂合突变(112183-112191)insA，18号外显子131252T→C(Leu1975Pro)；父亲FⅧ18号外显子存在相同突变，母亲FⅧ基因检测没有发现先证者的这2个突变。结论FⅧ14号外显子(112183-112191)insA与18号外显子131252T→C双重杂合突变可能是导致该患者HA的分子机制，其中18号外显子131252T→C为国际首次报道，14号外显子(112183-112191)insA为国内首次报道。     

高亲和度IgE受体β链基因多态性与过敏性哮喘相关性的研究

目的：检测Fcepsilon RI-beta三个突变位点H81L，V183L和E237G在中国南方汉族人群中的存在和频率分布；判断这些突变与哮喘及特应症的相关性。方法：利用扩增阻滞突变系统聚合酶使技术(ARMS—PCR)对60例哮喘患者Fc epsilon RI-beta基因编码181，183和237的三个氨基酸位点进行分析和检测，并与65例正常人进行对照。结果：在哮喘组中检测到1例1181L杂合子，被检人群中没有发现V183L突变。Glu237／C1y237在哮喘人群中的频率是18．3％，E237G突变基因频率为9．2％；Glu237／C1y237在特应性哮喘人群中的频率是22．6％E237G突变的基因频率为11．3％，G1u237／G1y237在正常对照人群中的频率是6．2％E237G突变的基因频率为3．1％。结论：在中国南方汉族人群中存在E237G突变。不存在V183L突变或突变率很低。E237G突变与哮喘有相关性(P＜0．05 OR＝3．18)；E237G突变与特应症有相关性(P＜0．025 OR＝4．00)，I181L突变的存在不确定。     

乙型肝炎病毒C区变异与拉米夫定治疗后HBVDNA反弹关系的研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)C区变异及变异位点与拉米夫定抗病毒治疗后HBVDNA反弹的关系.方法:应用PCR-序列分析法,多引物对巢式PCR法,检测10例用拉米夫定治疗的乙型肝炎患者(治疗组), 以及10例从未用过抗病毒治疗患者(对照组)的C区的突变位点及HBV基因型.结果:治疗组10例病人中4例检出有C区变异,变异位点分别为:I134V、P164Q、I126L E142D P159T及L84I I88V I126L P159A P164;对照组10例病人中有5例检出有C区变异,变异位点分别为: A83G、A83G P164Q、I126L P164Q、I126L P159T;其中I134V、E142D、L84I、I88V位点的变异仅出现在拉米夫定治疗后HBVDNA反弹的3例病人中,而且感染的HBV均为C基因型.结论:C区I134V、E142D、L84I、I88V位点变异可能与拉米夫定的耐药有关;感染C基因型的病人比B基因型的病人更易出现与拉米夫定耐药相关的C区变异.     

白念珠菌钙调蛋白基因单点突变重组质粒的构建和鉴定

目的；构建白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）单点突变重组质粒，为进一步探讨CMD1突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：采用PCR定点突变法，将CMD1编码C端3个苯丙氨酸（F89、F92和F141）的碱基分别定点突变成编码丙氨酸的碱基，构建CMD1单点突变重组表达质粒，并进行序列测定。结果：测序结果证实，所构建的3个重组质粒均含有相应的CMD1定点突变后的序列，F89^ ：TTC→GCT；F92^ :TTT→GCC；F141^ :TTT→GCC。结论：成功构建了3个CMD1单点突变重组表达质粒，为后续研究奠定了基础。     

云南籍葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变研究

目的研究云南籍葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变型特点，探讨检测G6PD缺乏症基因突变型的有效方法．方法应用硝基四氮蓝（NBT）纸片法进行G6PD缺乏症定性筛查，等位基因特异抗突变系统（ARMS），聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR—SSCP），变性梯度凝胶电泳（DGGE）和DNA测序分析46例云南籍G6PD缺乏症患者的G6PD基因突变类型．结果46例样本经PCR—ARMS法发现nt-1388G→A18例（39．13％），nt-1376G→T2例（4．30％）；经PCR—SSCP法发现有22例样本有电泳迁移率异常，其DNA测序结果与PCR—ARMS法的结果吻合，并发现2例nt-1311c→T；经PCR—DGGE法分析G6PDexon12发现有30例样本发现异常泳动条带，DNA测序证实26例（56．52％）为nt-1388G→A，4例（8．7％）nt—1376G→T．而PCR—DGGE法分析G6PDexon2未发现有异常泳动条带的样本．结论（1）nt—1388G→A、nt—1376G→T是云南省主要的基因突变型也是中国人中最常见的两种突变型，揭示中华民族有着共同的起源；（2）在检测突变的PCR—ARMS法、PCR—SSCP法和PCR—DGGE法三种方法中，以PCR—DGGE法结合DNA测序，阳性检出率高，简便、快捷、灵敏、结果准确可靠．     

乳腺癌患者BRCAl基因外显子11突变研究

目的：检测乳腺癌患者（breast and ovarian cancer susceptibility gene1，BRCAl）基因exonll突变情况及突变位置，探讨BRCAl突变与乳腺癌的关系。方法：采取105例乳腺癌标本为实验组，30例非癌乳腺组织为对照组。应用PCR—SSCP技术和DNA直接测序法检测所有标本BRCAl基因外显子11全部序列的突变情况。结果：30例非癌乳腺组织BRCAl基因外显子11未检出突变，105例乳腺癌中有10例发生基因突变，占总例数的9．5％。10例中2例为同义突变：2430T→ C，2630T→G；8例为错义突变：2532T→G，2685T→C（2例），3191C→G，3232A→G，3667A→G（2例），3876C→A。结论：BRCAl基因外显子11突变与乳腺癌的发生关系密切，对其进行检测可能对乳腺癌的患病风险评估及早期诊断具有重要意义。     

人原发性肝癌组织内抑癌基因PTEN的突变检测

目的 检测人原发性肝细胞性肝癌(HCC)组织中抑癌基因PTEN的突变。方法 采用PCR—SSCP技术和DNA测序技术检测60例HCC组织中PTEN的突变。结果 在60例配对HCC标本中，发现了共6个突变位点的存在。其中，出现在外显子内的突变有1个，即在31B号标本第4外显子中5’—侧翼下游13bP处检测到C→T的突变(89031C→T)，该突变导致了PTEN蛋白第84伉氨基酸由精氨酸变为赖氨酸。另外5个突变均位于内含子中，包括在34B号标本的第4外显子3’-侧翼下游106bP处的5碱基(AATAG)缺失突变、在9B号标本的第4外显子3’—侧翼下游67bP处检测到的一个G→T点突变(89125G→T)、在33B号标本的第6外显子3’—侧翼下游58bP处检测到的一个T→A点突变(110285T→A)、在44B号标本的第8外显子5’—侧翼上游29bP处检测到的一个C—T点突变(118833C→T)、在22B号标本的第8外显子5’—侧翼上游82bP处检测到一个A→C点突变(118780A→C)。在我们选择的SK—HEP—1、HePG2、Huh—7、ChangliVer和WRL68肝脏细胞中未检测到PTEN基因的突变。结论 肝癌组织中PTEN突变可能参与了原发性肝癌的形成。     

用等位基因特异性PCR筛查海南省黎族人β-地中海贫血IVSⅡ654（C→T）突变

目的：研究海南省黎族人群β-地中海贫血IVSⅡ654(C→T)突变的发病率。方法：应用等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)技术筛查海南省白沙、昌江、陵水、琼中、保亭等县黎族人群中β-地中海贫血IVSⅡ654(C→T)突变。结果：共筛查了788例黎族人DNA标本，未发现β-地中海贫血IVSⅡ654(C→T)突变。结论：IVSⅡ654(C→T)突变不是海南省黎族人群中主要的β-地中海贫血的基因类型。     

抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶（AT）基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制。方法构建AT野生型和突变体表达质粒（ATwt、ATT98I、ATA404T）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR（RT—PCR）检测转染细胞ATmRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径。结果ATT98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,ATA404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解。RT—PCR显示,与野生型ATmRNA相比,突变体ATmRNA不降低。脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解。蛋白降解抑制实验显示,突变体ATT98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解。转染细胞荧光染色显示,转染ATT98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染ATA404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集。结论分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制。     

颅内海绵状血管畸形CCM1基因突变的分析

目的探讨颅内海绵状血管畸形（ICM）患者CCM1基因突变的情况。方法收集经手术病理证实的ICM患者25例,均为汉族,其中家族性ICM7例。以30例正常健康人作为对照组。抽取两组对象的静脉血,提取基因组DNA、PCR,扩增CCM1基因8、9、11、12、13、15、16、17、18号外显子及部分两侧相邻的内含子、DNA测序,结果与GenBank比较。结果ICM患者中有11例被检测出7个新的CCM1基因突变,突变率为44％（11／25）。其中错义突变3个：12号外显子,1160A→C（Q387P）、1172C→T（S391F）;13号外显子,1405A→C（N469H）,插入突变2个：8号外显子,704insT（K246stop）;18号外显子,2138insG（T733stop）,内含子突变1个：IVS12-4C→T,同义突变1个：17号外显子,1875C→T（F625F）。除了1875C→T的同义突变可能为基因多态性以外,其他被发现的CCM1基因突变均导致编码KRIT蛋白的变化。对照组的CCM基因未检测出异常。家族性ICM的CCM1基因突变率高于散发性ICM,两者比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论国人ICM患者同样存在CCM1基因的突变,导致编码的KRIT1蛋白功能改变或缺失,这与ICM发病相关,是ICM发病的遗传学基础。     

HBV转录后调节序列中与干扰素α应答有关位点的初步鉴定与分析

目的：筛选乙型肝炎病毒（HBV）感染者转录后调节序列中与干扰素α治疗应答有关的差异位点。方法：采用PCR反应产物直接测序法，对31例HBV感染者血清中HBV DNA上的转录后调节序列（HPRE）片段扩增后测序，与GenBank中来源于欧美人群的乙型肝炎序列进行比较，并结合临床资料进行分析。结果：在中国慢性HBV感染者HPRE的β2区，存在3个位点变化，分别为ntI504(T→C），占75．0％，nt1508(C→T)，占57．1％（C→G），占10．7％；nt1509(C→T)占60．9％。而在欧美HBV感染者的HBV DNA序列中均不存在上述位点变化。HPRE位点差异的发生率与HBV DNA水平未见明显相关。结论：不同种族HBV感染者转录后调节序列的差异可能与干扰素α治疗的应答性有关。     

人IL-17F重组逆转录病毒载体的构建及其在293T细胞中的稳定表达

目的构建hIL-17F重组逆转录病毒载体并研究它在293T细胞中的表达。方法以测序验证的pUCm-T/hIL-17F为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因片段(包括20aa信号肽序列,而且hIL-17F基因内EcoR I酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变,即AA T→AA C,均为Asn),并正向插入逆转录病毒载体pSIV-1后经PCR、双酶切和测序鉴定。将构建正确的pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,采用脂质体法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染293T细胞,经G418筛选获得阳性细胞株,并应用PCR、RT-PCR和dot-ELISA法检测hIL-17F目的基因在293T细胞中的整合、转录和表达。结果成功构建了hIL-17F基因内EcoRI酶切位点GAA T TC→GAA C TC同义点突变的重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F,并在293T细胞中稳定表达。结论以逆转录病毒为载体感染的稳定表达rhIL-17F的293T转基因细胞株的首次获得,为进一步研究hIL-17F的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。     

人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析

目的：探讨人食管癌DNA聚合酶beta(polβ)基因突变的特点。方法：对75例人食管癌组织及4例正常对照组织中提取总RNA,进行RT→PCR,对PCR产物克隆后以Sanger‘s法测序。结果：人食管癌标本的polβ基因突变率36％(27／75)。突变形式包括：①A：G转换,突变频率为66．7％(18／27),375位的A→G(Ⅱe→Val)、466位G→A(Gly→Glu)、660位A→G(Arg→Gly)、670位A→G(Glu→Gly)、740位A→G(Lys未改变);②T：C转换,突变频率18．5％(5／27),454位T→C(Phe→Ser)、665位T→C(Gly未改变);③G：T颠换,突变频率18．5％(5／27),462位G→T((Ylu→提前终止于116aa);④A：T颠换,突变频率18．5%(5／27),613位A→T(Lys→Ⅱe)、737位A→T(Pro未改变);⑤G：C颠换,突变频率7．4％(2／27),648位G→C(Gly→Arg);⑥177-234位的58bp缺失,移码及提前终止,突变频率为37％(10／27)。结论：人食管癌组织polβ基因突变具有以下特点：①标本突变率达36％(27／75);②有以A：G转换和G：T颠换为热点等多种突变形式;③2种提前终止可产生2种截短的polβ蛋白,1种具有116氨基酸长度;另一种58bp的缺失者仅有26氨基酸长度。     

Fast COLD-PCR/Sanger测序法对乙型肝炎患者不同耐药基因突变类型检测的应用研究

(1)Fast COLD-PCR/Sanger测序法对不同突变类型的检测浓度有所不同,对突变株DNA的最低检出限可从5.0 E+01 IU/m L-1.0 E+03 IU/m L不等;Full COLD-PCR/Sanger测序法对单一突变类型的检测浓度大致相同,突变DNA浓度约≥5.0 E+02 IU/m L时即可检出,对混合突变类型时最低检出限可提高至1.0 E+02 IU/m L。(2)常规PCR/Sanger测序对所有类型突变株的检出灵敏度均为10%(突变型:野生型比例为1:10,下同)。对于单一位点的突变类型,当发生熔解温度(melting temperature,Tm)下降的突变(如C:G→T:A等)时,Fast COLD-PCR对突变株的检出灵敏度达1%,Full COLD-PCR则为2%;对Tm不变或升高的突变(如C:G→G:C或T:A→C:G等),仅有Full COLD-PCR可提高对突变株的灵敏度为2%。对于多位点突变类型,Fast COLD-PCR与Full COLD-PCR法检出突变的灵敏度可进一步提高为0.5%和1%。