重组水蛭素Ⅲ的中试工艺研究

从大肠杆菌中大规模纯化重组水蛭素Ⅲ,进行重组水蛭素Ⅲ中试发酵工艺和纯化中试工艺研究,连续大量纯化3批,并对纯化终产品进行鉴定。通过菌种活化,一级、二级种子液制备,30L发酵罐补料-批式发酵水蛭素产量达到6000ATU/ml,发酵液经还原性SDS-PAGE分析表明在14000u处有单一条带,为重组水蛭素Ⅲ二聚体。经大孔树脂层析、DEAE-纤维素层析、制备型反相高效液相层析等3步纯化后重组水蛭素Ⅲ的比活达8270ATU/mg。经分析型反相高效液相色谱分析,纯度达95%以上,总收率达到39%以上。通过实验建立了稳定的发酵和纯化工艺流程。     

用大孔树脂提取和纯化五味子总木脂素

目的以五味子中有效成分五味子醇甲、五味子甲素及五味子乙素含量为考察指标,筛选分离纯化五味子总木脂素的最佳树脂;研究不同大孔吸附树脂及其不同的工艺条件对总木脂素分离纯化的影响;建立五味子总木脂素的纯化方法。方法大孔吸附树脂与阴离子交换树脂(脱色树脂)联合使用,采用静态与动态的吸附-解吸两种模式进行纯化;通过动态吸附曲线观察吸附量及洗脱能力;利用HPLC法验证纯化后五味子醇甲、五味子甲素及五味子乙素的含量;上样吸附后,用5倍量柱床体积的水洗除杂,再用体积分数为95%的乙醇洗脱,用量为6倍量柱床体积。结果弱极性树脂AB-8适合用于五味子总木脂素的纯化;纯化后,五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素3种有效成分含量的质量分数之和由1.197%提高到14.92%,总转移率为72.3%。结论用大孔树脂提取和纯化五味子总木脂素的方法在保留五味子中有效成分的同时,显著降低固形物得率,可用于工业推广。     

胸腺素a_1的分离纯化

化学合成胸腺素a1采用阴离子交换色谱和制备型RP-HPLC两步纯化。阴离子交换色谱以pH8.0的Tris-HCl为缓冲液,0～0.35mol/L NaCl溶液离子强度梯度洗脱;制备型RP-HPLC采用C18柱,流动相A为0.1%三氟乙酸-H2O,流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈,线形梯度10%～35%B,0～60min洗脱,流速2.0ml/min,检测波长214nm。纯化结果采用分析型RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE检测,终产物纯度达98.8%以上。     

胸腺素α1的分离纯化

化学合成胸腺素α1采用阴离子交换色谱和制备型RP-HPLC两步纯化.阴离子交换色谱以pH8.0的Tris-HCl为缓冲液,0～0.35mol/L NaCl溶液离子强度梯度洗脱;制备型RP-HPLC采用C18柱,流动相A为0.1%三氟乙酸-H2O,流动相B为0.1%三氟乙酸-90%乙腈,线形梯度10%～35%B,0～60min洗脱,流速2.0ml/min,检测波长214nm.纯化结果采用分析型RP-HPLC和Tricine-SDS-PAGE检测,终产物纯度达98.8%以上.     

多黏菌素B中多种单体的制备

目的 ：运用反相制备液相色谱从多黏菌素B中分离得到高纯度的多黏菌素各单体。方法 ：通过选择不同规格的制备色谱柱和上样量、调整流动相梯度洗脱的程序，筛选出适用于多黏菌素B单体制备的条件。结果 ：洗脱液经多次纯化、减压浓缩、冷冻干燥后获得纯度大于96%的6个高纯度的单体，并经质谱确认。结论 ：本研究建立的方法可快速、高效、经济地制备多黏菌素B的多个单体。     

AB-8大孔树脂纯化五味子木脂素工艺研究

目的 研究AB-8大孔吸附树脂分离纯化五味子木脂素的工艺条件。方法 采用高效液相色谱法对五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素进行定量分析,通过考察静态和动态吸附、洗脱效果,筛选AB-8大孔吸附树脂分离纯化五味子木脂素的最佳工艺条件,对加样量、上样液浓度、洗脱速度和乙醇浓度进行考察。结果 AB-8大孔树脂分离五味子木脂素的最佳工艺条件为：上样量1 BV（bed volume）,上样液质量浓度9.159~16.523 mg/ml,树脂柱径高比1：5,吸附流速2.5 BV/h,吸附后用5 BV的30%乙醇洗脱,再以10 BV的95%乙醇洗脱,纯化处理后五味子木脂素总含量达到22.06%,转移率高达77.07%。结论 AB-8大孔吸附树脂能有效分离纯化五味子木脂素,该方法具有操作简单、成本低廉等突出优点,有较高的工业生产应用价值。     

细菌素产生菌的筛选及其细菌素的分离纯化

从香肠中分离得到一株产细菌素的乳酸片球菌，其发酵液经硫酸铵沉淀，CM—Sephadex C50阳离子交换柱层析后，得到的细菌素样品通过SDS—PAGE证明是一条带，分子量约20．83ku，该细菌素对热及酸碱稳定，易被酶降解而失去活性，对许多革兰氏阳性茵有较强的抑制作用，而对革兰氏阴性茵、酵母和霉没有作用。     

重组人红细胞生成素大规模制备中反相色谱的条件优化

目的优化重组人红细胞生成素(rhEPO)大规模制备纯化中主要影响回收率的反相色谱的条件,提高回收率。方法采用反相纯化作为三步法纯化的第一步,利用R1型反相填料采用不同分步洗脱条件进行洗脱。结果优化后经第一步反相色谱所得rhEPO蛋白纯度达70%,再通过阴离子交换和凝胶过滤色谱纯化,rhEPO终产物的纯度可达100%,体内比活达1.91×105IU/mg,rhEPO蛋白的回收率提高了1.2倍。结论优化的反相纯化条件(30%乙醇-1.5 mol/L尿素,60%乙醇-3.0 mol/L尿素)能更有效的从培养上清中大量纯化出rhEPO,回收率高。获得的产品纯度高,体内外活性好。适合大规模纯化。     

Sephadex G-25对乳酸链球菌素溶液脱盐的研究

目的研究乳酸链球菌素的凝胶过滤脱盐法。方法比较在Sephadex G-25柱上加样量、加样体积、洗脱流速和高径比对脱盐效果的影响。结果确定了乳酸链球菌素的最佳脱盐工艺为:色谱柱高径比15:1,加样体积为每毫升凝胶0.1mL料液、加样量为每毫升凝胶7×104IU、用pH3.45的醋酸缓冲溶液在0.6mL/min流速下洗脱。在此条件下,乳酸链球菌素的脱盐收率和回收率都在90%以上。结论 Sephadex G-25能有效的将乳酸链球菌素和盐分离。     

北虫草中虫草素和虫草多糖的提取纯化研究

目的研究北虫草中虫草素和虫草多糖的提取纯化工艺。方法采用正交实验法研究提取工艺,采用柱分离法,以虫草素和虫草多糖的含量为指标,考察流速、上样体积和洗脱剂浓度对纯化工艺的影响。结果提取的最佳工艺为:加10倍量水,回流提取3次,每次1h。优化的纯化工艺为:将提取液浓缩至1mL,相当于北虫草粉0.1g,以2BV·h~(-1)的流速上样,上样体积为0.6BV,先用2BV的水洗脱,再用4BV体积分数为40%的乙醇溶液以1～2BV·h~(-1)的流速洗脱,收集乙醇洗脱液。结论该提取纯化工艺经验证实验证明可行。     

HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺研究

目的:优化HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺条件。方法:考察上柱药液的pH值、药液的浓度、柱径/柱高的比例、洗脱乙醇浓度、洗脱溶剂用量、上样流速考察、最大上样量及洗脱流速,确定纯化工艺条件。结果:HPD300型大孔吸附树脂分离纯化白芍总苷的工艺条件为上样浓度0.1g生药/mL,流速4BV.h-1,树脂柱径/高比为1∶11,以5倍柱体积水洗脱,继以7倍柱体积50%乙醇洗脱。结论:确定工艺条件下,纯化白芍总苷效果良好,芍药苷的纯度可达50%以上,白芍总苷纯度可达80%以上。     

硅胶柱层析法分离纯化表没食子儿茶素没食子酸酯

目的 优化表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的分离纯化条件。方法 采用硅胶柱层析法，用氯仿和乙酸乙酯对儿茶素富集物进行萃取富集，考察洗脱条件（洗脱剂的类型、体积分数、pH、流速）及上样量对EGCG分离纯化效果的影响，收集高纯度的EGCG馏分，采用高效液相色谱（HPLC）法对儿茶素单体进行检测。结果 最佳洗脱条件为，儿茶素富集物上样量为0.4 g，以80%乙醇为洗脱剂，在pH 4.0、流速3 mL/min条件下进行洗脱。在此条件下，EGCG得率为81.79%，纯度为91.14%。结论 硅胶柱层析法具有方便、快速、纯化分离效果好等优点，可经济、有效地分离出高纯度EGCG。     

一步阳离子柱层析高效纯化溶菌酶及其溶菌活性

目的:研究利用离子交换层析从鸡蛋清中快速高效地纯化溶菌酶的方法。方法:蛋清稀释后先利用等电点沉淀去除卵清蛋白、类卵黏蛋白等部分杂质,之后利用快流速羧甲基-琼脂糖凝胶柱层析进行纯化,收集洗脱峰样品进行冷冻干燥;以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测溶菌酶纯度,以溶壁浊度法检测酶活力。结果:在等电点除杂后,经一步阳离子柱纯化,溶菌酶的纯度达到95%以上,比活力达到17600U/mg,收率达到4.2mg(溶菌酶)/m(l蛋清)。结论:所建立的一步阳离子柱层析法可高效快速地从鸡蛋清中纯化溶菌酶。     

从结晶母液中提取分离卡那霉素A、B的工艺优化研究

以卡那霉素提取工艺产生的结晶母液为原料 ,通过比较不同类型阳离子交换树脂的吸附性能 ,筛选出卡那霉素 B富集率高和杂质吸附率较低的 D4 阳离子交换树脂。采用多因素多水平的正交试验设计 ,确定了较佳的吸附富集条件为 :上柱结晶母液 p H7.0 ,上柱母液浓度 1.2 6万 u/ ml,吸附流速 1.5 V/ (v· h) ;进一步确定了较佳的除杂质洗脱条件为 :硫酸铵溶液浓度 1.5 % (v/ v) ,p H7.5 ,流速 1.75 V/ (v·h)。通过在阳离子交换树脂上的吸附富集和除杂质处理后 ,再用 4 %氨水将卡那霉素洗脱下来 ,将洗脱液浓缩 ,再经过 A4阴离子交换树脂层析分离 ,可获得高纯度的卡那霉素 A、B成品     

从发酵液中分离提取卡那霉素的新工艺研究

以卡那霉素发酵液为原料 ,通过比较不同类型阳离子交换树脂的吸附特性 ,筛选出卡那霉素B的吸附率高、杂质吸附量较低和卡那霉素吸附总量较高的D4阳离子交换树脂。确定了较佳的吸附富集条件为 :上柱发酵液的pH7.0 ,吸附流速 1.5v/(v·h) ;进一步确定较佳的除杂洗脱条件为 :硫酸铵溶液浓度 1.0 %(v/v) ,pH7.5 ,流速 1.2 5v/(v·h)除杂质。最后用 4%(v/v)氨水洗脱。经过在阳离子交换树脂上的吸附富集和除杂质后 ,可以将发酵液卡那霉素中约含 2 .5 %的卡那霉素B组分提高到 6%以上。通过采用多柱串联工艺流程 ,达到分离富集卡那霉素B组分 ,提高卡那霉素碱成品 (卡那霉素A碱 )纯度的目的     

RP-HPLC法测定人血浆中血管紧张素Ⅱ的浓度

目的:建立以反相高效液相色谱(RP-HPLC)-荧光法检测人血浆中血管紧张素Ⅱ浓度的方法。方法:采用固相萃取法纯化血浆样本,以荧光胺柱前衍生后进样测定。以乙腈-10mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(pH8.5)作为流动相,梯度洗脱,流速为1mL·min-1,色谱柱为LunaC5,激发波长为273nm,发射波长为476nm。结果:血管紧张素Ⅱ血药浓度在10～200ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9995),最低检出限(S/N=3)为5ng·mL-1,日内、日间RSD分别为1.65%和4.20%。结论:本方法快速、灵敏、准确、重复性好,可用于血浆中血管紧张素Ⅱ浓度的检测。     

阳离子交换树脂酸水洗脱法纯化苦参总碱的工艺优选

目的优选阳离子交换树脂不同浓度盐酸溶液洗脱纯化苦参总碱的最佳工艺条件。方法以苦参碱、氧化苦参碱和总生物碱的洗脱率为考察指标,以盐酸溶液作为洗脱剂,优选阳离子交换树脂纯化苦参总碱的最佳工艺和参数条件。结果苦参总碱阳离子交换树脂纯化洗脱条件为:以5%盐酸溶液作为洗脱剂,以6 BV.h-1的流速洗脱,苦参碱和氧化苦参碱、苦参总碱洗脱率均可达85%。结论采用阳离子交换树脂酸水洗脱法纯化苦参总碱效率高,工艺简便,可用于苦参总碱的提取纯化。     

RP-HPLC法测定妇炎康片中丹参素的含量

目的:建立测定妇炎康片中丹参素含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱柱为Lichrospher C18柱,流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液(梯度洗脱),流速为1.0mL·min-1,检测波长为280nm,进样量为10μL,柱温为40℃。结果:丹参素进样量在0.21～0.84μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9996),平均回收率为98.4%,RSD=2.1%(n=9)。结论:本法简便、准确、重复性好,可用于妇炎康片的质量控制。     

博落回提取物中血根碱的离子交换树脂分离纯化工艺研究

目的:建立博落回提取物中血根碱的离子交换树脂分离纯化工艺。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)测定博落回提取物中血根碱含量,色谱柱为Cosmosil C18-R-Ⅱ(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%醋酸溶液(25∶75,V/V),流速为1 m L/min,检测波长为270 nm,柱温为30℃,进样量为20μL。通过静态吸附与解吸附试验,对比8种离子交换树脂对血根碱的吸附和解吸附性能;采用优选离子交换树脂,考察最佳上样液浓度、上样pH值以及上样体积;采用APPS 10D液相制备系统,考察动态洗脱条件,获得博落回精提物溶液;采用反相C18色谱柱对博落回精提物溶液脱盐、洗脱并干燥,获得精制纯化物。采用HPLC法测定所得精制纯化物的纯度,并采用HPLC法、紫外分光光度法、质谱法、核磁共振法分别对其进行结构确证。结果:筛选获得CM-FF型树脂用于博落回提取物中血根碱的分离纯化,以含20%甲醇、0.25 mol/L氯化钠的20 mmol/L醋酸铵溶液100 mL进行洗脱。优化的动态吸附条件为上样浓度6.0 mg/mL、上样pH值5.5、上样体积25 mL;洗脱精提物经脱盐和精制后,最终获得纯度为97%的精制纯化产物(纯化收率为71%),并经结构确证其为血根碱。结论:优选的离子交换树脂分离纯化工艺绿色环保、安全高效、易于操作,可用于博落回提取物中血根碱单体的分离纯化,适合工业化生产。     

醋制延胡索中延胡索乙素的纯化工艺研究

目的研究醋制延胡索提取液中延胡索乙素的提取纯化工艺。方法以延胡索乙素转移率、百分含量和浸膏收率为指标,采用石硫法、水提醇沉法、D101大孔吸附树脂和732型阳离子交换树脂等方法,综合评价延胡索提取液的纯化工艺参数。结果采用732型阳离子交换树脂优于其他3种方法,延胡索乙素的转移率>70%、浸膏收率<2.5%,浸膏中延胡索乙素含量达1.2%,是原药材中含量的30倍。结论 4种纯化方法中,732型阳离子交换树脂对醋制延胡索70%醇提液的纯化效果最好,验证实验表明,该工艺稳定可行。