hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ，反式插入方向培养上清没有活性     

G418选择与稳转克隆表达分泌hGM-CSF的相关性考察

目的：进一步考察不同Ｇ４１８维持用量与ｒｈＧＭ－ＣＳＦ表达水平相关性。方法：第２期历时３个月（第４～６个月），本室构建的ＣＨＯ－ｒｈＧＭ－ＣＳＦ稳转克隆，在不同Ｇ４１８维持用量（０、３００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ）下传２５代左右，各批次传代上清用依赖ＧＭ－ＣＳＦ生长的ＴＦ－１细胞作ＭＴＴ活性测定。结果：无Ｇ４１８选择维持，ＣＨＯ稳转细胞株表达和分泌ｈＧＭ－ＣＳＦ的水平从第４个月开始下降，再次加Ｇ４１８（６００μｇ／ｍｌ）后，ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达水平迅速回升，２周后至正常。结论：Ｎｅｏ抗性基因作为遗传选择标志进入真核细胞，上述结果对于选择Ｇ４１８用量以维持宿主细胞表达分泌目标蛋白具有一定参考价值。     

阳离子脂质体介导hGM-CSF真核表达载体在骨髓基质细胞系中的表达

目的 构建人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）真核表达载体ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ／ｈＧＭ－ＣＳＦ,并观察其在人骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ中的表达,方法 用ＤＮＡ重组技术,将ｈＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ插入到真核表达载体ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ的多砍隆位点中,获得阳性重组载体ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。以脂质体介导法转染人骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ细胞筛选获得的阳性细胞用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ方法分别检测其基因组ＤＮＡ整合和ｍＲＮＡ转录,用ＥＬＩＳＡ及依赖株（ＴＦ－１）法检测其蛋白表达量和活性。结果 酶切鉴定表明成功地构建了重组真核表达载体ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ／ｈＧＭ－ＣＳＦ;ｈＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到ＨＦＣＬ细胞基因组ＤＮＡ中,在ｍＲＮＡ和蛋白质水平上均可检测到其表达;ｈＧＭ－ＣＳＦ的表     

人GM—CSF基因转染小鼠肝癌细胞及其致瘤性研究

为建立以腺病毒为载体的ＧＭ－ＣＳＦ基因转染瘤苗，并研究其体内抗肿瘤作用，应用携带有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组腺病毒（Ｒ－Ａｄ５）载体转染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠肝癌细胞株（Ｈ２２），体外应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ法），检测ＧＭ－ＣＳＦ表达水平，以ＧＭ－ＣＳＦ基因转染的Ｈ２２细胞进行致瘤性研究。结果：（１）重组腺病毒载体能成功地介导ＧＭ－ＣＳＦ基因转染Ｈ２２细胞并能持续有效表达２６￣３１天，瘤苗的辐照处     

CHO-rhGM-CSF克隆稳定性与不同浓度G418维持选择相关性分析

ＣＨＯｒｈＧＭＣＳＦ克隆稳定性与不同浓度Ｇ４１８维持选择相关性分析陈静娴宋宁陈强钙磷ＤＮＡ沉淀法转染我组构建的重组人粒巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭＣＳＦ）ｐＭＥｎｅｏ质粒进入中国仓鼠卵细胞（ＣＨＯ），经Ｇ４１８选择后得到稳定表达ＧＭＣＳＦ...     

G—CSF对化疗后外周血干细胞动员作用的影响

通过对１１例急性白血病患单独化疗与化疗后加用粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）的对比，动态观察了Ｇ－ＣＳＦ对外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）的动员作用。发现化疗后加用Ｇ－ＣＳＦ比单用化疗的粒－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）增加５．１倍，红系式集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅ）增加４．５倍。Ｇ－ＣＳＦ还可使ＣＦＵ＞１００／ｍｌ和ＢＦＵ－Ｅ＞２００／ｍｌ的持续时间延长；化疗后ＣＦＵ－ＧＭ的最高值提早出现，而     

caspase 3在细胞因子调节急性白血病细胞凋亡中的变化

目的 研究ｃａｓｐａｓｅ３在粒细胞集落刺激因子（Ｃ－ＣＳＦ）和粒巨洚细胞集落因子（ＧＭ－ＣＳＦ）调节白血病细胞系ＮＢ４细胞凋亡过程中的变化及其意义。方法 利用细胞这、流式细胞仪分析及ＤＮＡ片段化比率测定,检测Ｇ－ＣＳＦ及ＤＭ－ＣＳＦ对ＮＢ４细胞凋亡的影响,应用荧光分光光度法检测ｃａｓｐａｓｅ３活性变化,并利用ＡＥ－ＤＥＶＤ－ＣＲＯ进行ｃａｓｐａｓｅ３抑制试验。结果 Ｇ－ＣＳＦ能诱导ＮＢ４细胞凋亡,     

粒-巨噬系集落刺激因子和红细胞生成素诱导 JAK2 酪氨酸磷酸化并使之激活

目的：确定与细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化相关的激酶。方法：用粒－巨噬系集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和红细胞生成素（Ｅｐｏ）依赖细胞株ＵＴ－７以及Ｅｐｏ依赖细胞株ＵＴ－７／Ｅｐｏ进行酪氨酸磷酸化的研究。结果：当ＧＭ－ＣＳＦ或Ｅｐｏ刺激其生长依赖细胞时可快速诱导分子量为１４５０００，１３００００，８００００和４００００等多种蛋白质酪氨酸磷酸化。鉴定了分子量为１３００００酪氨酸磷酸化的蛋白质为ＪＡＫ２，一种非受体型酪氨酸激酶。同时，ＧＭ－ＣＳＦ或Ｅｐｏ刺激亦可激活ＪＡＫ２激酶活性。酪氨酸磷酸化和激活ＪＡＫ２只发生在ＧＭ－ＣＳＦ或Ｅｐｏ生长依赖细胞。结论：ＪＡＫ２信号传导途径在ＧＭ－ＣＳＦ和Ｅｐｏ诱导的细胞增殖中起重要作用。     

G－CSF对化疗后外周血干细胞动员作用的影响

通过对１１例急性白血病患者单独化疗与化疗后加用粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）的对比，动态观察了Ｇ－ＣＳＦ对外周血造血干细胞（ＰＢＳＣ）的动员作用。发现化疗后加用Ｇ－ＣＳＦ比单用化疗的粒－巨噬细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＧＭ）增加５．１倍，红系爆式集落形成单位（ＢＦＵ－Ｅ）增加４．５倍。Ｇ－ＣＳＦ还可使ＣＦＵ－ＧＭ＞１００／ｍｌ和ＢＦＵ－Ｅ＞２００／ｍｌ的持续时间延长；化疗后ＣＦＵ－ＧＭ的最高值提早出现，而不影响ＢＦＵ－Ｅ／ＣＦＵ－ＧＭ比值。结果表明，化疗后加用Ｇ－ＣＳＦ可明显提高ＰＢＳＣ的收集效率，Ｇ－ＣＳＦ是一种有效的ＰＢＳＣ动员剂。     

联合化疗加入基因重组粒细胞集落刺激因子动员造血干细胞及其外？…

目的 联合化疗加入基因重组粒细胞集落刺激因子方案在自身外周血干细胞移植中动员造血干细胞的作用及临床效果,以寻找有效的造血干细胞动员方案。方法：动员方案以联合人 加ｈｒＧ－ＣＳＦ为主,联合化疗方案包括ＤＡ、ＨＡ、ＤＯＬＰ、ＭＰ等,每日ｈｒＧ－ＣＳＦ１～３μｇ／ｋｇ连用１ｄ～６ｄ,结果：动员时间２５．２０ｄ±１３．７４ｄ。ＭＮＣ采集量为（１．０１±０．７９）×１０＾８／ｋｇ,ＧＭ－ＣＦＵ为（４．５９±     

人胎盘无细胞是悬液对骨髓造血干／祖细胞的体外扩增作用

为了探讨人胎盘无细胞悬液对骨髓造血干／祖细胞的体外扩增作用及与已知的几种细胞因子进行比较,用人胎盘无细胞悬液及ＩＬ－３,ＧＭ－ＣＳＦ,ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＦＰＯ作为刺激因子,并应用甲基纤维素半固体培养体 对骨髓ＧＭ－ＣＦＵ,ＧＭ－ＧＥＭＭ和ＢＦＵ－Ｅ进行了培养和比较,研究结果表明,人胎盘无细胞悬液对骨髓ＣＦＵ－ＧＭ,ＣＦＵ－ＧＥＭＭ和ＢＦＵ－Ｅ体外扩增最适蛋白浓度是２００－３００μｇ／Ｌ,人胎盘无细胞悬液作刺激因子对骨髓血干／祖细胞的体外扩增效果优于单独ＩＬ－３,单独ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＥＰＯ组。结论提示,人胎盘无细胞悬液可能含有多种细胞因子,用人胎盘无细胞悬液作扩增剂体外扩增骨髓造血干／祖细胞细胸具有有效而价廉的特点。     

GM—CSF基因转染瘤苗对小鼠T淋巴细胞亚群及生存期的影响

将携带有人粒细胞－巨噬细胞落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因的重要病毒载体的转染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠肝癌细胞株（Ｈ２２）体我经＾６０Ｃｏγ射线灭活后制成瘤苗，用以治疗荷瘤小鼠，应用流式细胞仪（ＦＣＭ）测定荷瘤小鼠外周血Ｔ淋巴细胞亚群的变化，并观察荷瘤小鼠生存期。结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ基因转染瘤苗能量显著提高小鼠外周血ＣＤ＾＋８Ｔ淋巴细胞亚群的含量，荷瘤小鼠生存期显著延长，结果表明，ＧＭ－ＣＳＦ基因转染瘤苗     

IL—6和GM—CSF对人多发性骨髓瘤细胞与血管内皮细胞粘附效应…

用＾５１Ｃｒ标记细胞株的方法，研究了白细胞介素６（ＩＬ－６）及粒－巨噬系集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）对人多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞株（Ｕ２６６、ＸＧ－７）、ＥＢ病毒阳性细胞株（Ｄａｕｄｉ）和内皮细胞间粘附的调控作用，观察了粘附作用对ＸＧ－７细胞表面粘附分子表达的影响。结果表明：①ＩＬ－６及其受体（ＩＬ－６Ｒ）ｇｐ１３０相关性生长因子ＧＭ－ＣＳＦ不仅是人ＭＭ细胞体内、外的生长因子，而且可以提高ＭＭ细胞     

巨细胞病毒对人骨髓粒-巨噬系祖细胞生长的影响

目的探讨人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）对人骨髓粒巨噬系祖细胞集落（ＣＦＵＧＭ）是否有直接抑制作用。方法采用造血祖细胞体外培养技术,研究病毒株ＨＣＭＶＡＤ１６９对ＣＦＵＧＭ生长的影响,用原位聚合酶链反应（ＩＳＰＣＲ）技术检测ＣＦＵＧＭ的细胞内ＨＣＭＶＡＤ１６９ＤＮＡ。结果高浓度ＨＣＭＶＡＤ１６９（２×１０６ｐｆｕ／ｍｌ和２×１０５ｐｆｕ／ｍｌ）在体外能明显抑制ＣＦＵＧＭ的生长（Ｐ＜０．０１）,而低浓度（２×１０４ｐｆｕ／ｍｌ）ＨＣＭＶＡＤ１６９则无此作用,ＨＣＭＶＡＤ１６９对骨髓ＣＦＵＧＭ的抑制作用因其浓度的不同而有差异;经ＩＳＰＣＲ检测发现在ＣＦＵＧＭ的细胞核中存在ＨＣＭＶＡＤ１６９ＤＮＡ。结论ＣＦＵＧＭ是ＨＣＭＶＡＤ１６９的宿主细胞之一,ＨＣＭＶＡＤ１６９对骨髓ＣＦＵＧＭ生长的抑制作用与其对ＣＦＵＧＭ的直接感染有关。     

粒—巨噬系集落刺激因子和红细胞生成素诱导JAK2酪氨酸磷酸化…

目的：确定与细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化相关的激酶。方法：用粒－巨噬系集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和红细胞生纱（Ｅｐｏ）依赖细胞株ＵＴ－７以及Ｅｐｏ依赖细胞株ＵＴ－７／Ｅｐｏ进行酪氨酸磷酸化的研究。结果：当ＧＭ－ＣＳＦ或Ｅｐｏ刺激其生长依赖细胞时可快速诱导分子量为１４５０００，１３００００，８００００和４００００等多种蛋白质酷氨酸磷酸化。鉴定了分子量为１３００００的酪氨酸磷酸化的蛋白质为ＪＡＫ２，一种     

基因重组干扰素γ体外对骨髓增生异常综合征患者造血祖细胞的作用

对基因重组干扰素γ（ＩＦＮ－γ）体外对３２例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）患者造血祖细胞的作用进行了研究，结果如下：①ＭＤＳ患者ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ明显低于对照组，ＣＦＵ－Ｅ减低者占３０／３２例，ＣＦＵ－ＧＭ减低者占３１／３２例。②ＩＦＮ－γ体外可促进ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ数增加，其作用为剂量依赖型，在ＩＦＮ－γ浓度为１００Ｕ／ｍｌ时达最大值。③ＩＦＮ－γ对ＭＤＳ患者ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ的促增殖作用与患者自身集落数有关，在自身集落数正常和稍减低者这种作用最明显，在明显减低者这种作用小甚至为０．④上海和日本二种干扰素作用相似，无显著差异。以上结果提示ＩＦＮ－γ对ＭＤＳ治疗可望产生良好效果。     

IL－6和GM－CSF对人多发性骨髓瘤细胞与血管内皮细胞粘附效应作用的研究

用￣（５１）Ｃｒ标记细胞株的方法，研究了白细胞介素６（ＩＬ－６）及粒－巨噬系集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）对人多发性骨髓瘤（ＭＭ）细胞株（Ｕ２６６、ＸＧ－７）、ＥＢ病毒阳性细胞株（Ｄａｕｄｉ）和内皮细胞间粘附的调控作用，观察了粘附作用对ＸＧ－７细胞表面粘附分子表达的影响。结果表明：①ＩＬ－６及其受体（ＩＬ－６Ｒ）ｇｐ１３０相关性生长因子ＧＭ－ＣＳＦ不仅是人ＭＭ细胞体内、外的生长因子，而且可以提高ＭＭ细胞－内皮细胞间的粘附能力，有助于ＭＭ细胞的扩散；②粘附作用亦能引起肿瘤细胞ＸＧ－７表面ＣＤ＿（１１ａ）、ＣＤ＿（５４）、ＣＤ＿（４４）、ＣＤ＿（４９ｄ）表达的异常改变；③ＣＤ＿（４９ｄ）及其配体的相互作用可能参与了ＭＭ细胞与内皮细胞的粘附过程。     

HSV-tk/GCV自杀基因疗法及其影响树突状细胞功能的实验研究

目的 研究单纯疱疹病毒－胸苷激酶／更昔洛韦（ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ）自杀基因系统的特性,探讨转ＨＳＶ－ｔｋ基因后,肿瘤细胞被更昔洛韦（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）杀伤时的凋亡现象及对树突状细胞功能的影响。方法 以逆转录病毒法将ＨＳＶ－ｔｋ基因转人乳腺癌细胞株ＭＣＦ－７中,以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法对肿瘤细胞基因组ＤＮＡ中ｔｋ基因的整合进行鉴定,以流式细胞仪及电镜观察ＧＣＶ杀伤ＭＣＦ－７／ｔｋ细胞时的凋亡现象,由脐血ＣＤ３４＾＋细胞诱生树突状细胞,以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测树突状细胞刺激同种异体Ｔ淋巴细胞增殖的能力。结果 以逆转录病毒法成功地将ＨＳＶ－ｔｋ基因转入ＭＣＦ－７细胞中,转染ｔｋ基因的ＭＣＦ－７细胞能被ＧＣＶ有效杀伤并存在凋亡现象,凋亡率可达３１．３％;由脐血ＣＤ３４＾＋细胞在ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ     

家兔脑缺血再灌注损伤机制的研究

用家兔四动脉闭塞法建立急性完全性脑缺血后给予再灌注，观察缺血前后及再灌注后脑组织部分电解质和含水量、脑组织和血液丙二醛（ＭＤＡ）、环核昔酸（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）、血栓烷Ｂ＿２（ＴｘＢ＿２）、６－酮－前列腺素Ｆ＿（１α）（６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ＿（１α）含量、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和谷胱苷肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性改变。结果：再灌注后实验组脑组织Ｃａ￣（２＋）、ＭＤＡ、ＴｘＢ＿２和ｃＡＭＰ较对照组升高（Ｐ＜０．０５），ＧＳＨ－Ｐｘ活性、６－ｋｅｔｏ－ＰＧＦ＿（１α）含量降低（Ｐ＜０．０５）；实验组血液中ｃＡＭＰ含量高于对照组（Ｐ＜０．０５）。提示脑组织Ｃａ￣（２＋）过载、氧自由基增多、ｃＡＭＰ／ｃＯＭＰ和ＰＧＩ＿２／ＴＸＡ＿２比值异常在脑缺血再灌注损伤中起着重要的作用。     

基因重组干扰素γ体外对骨髓增生异常综合征患者造血祖细胞的…

对基因重组干扰素γ（ＩＦＮ－γ）体外对３２例骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）患者造血祖细胞的作用进行了研究，结果如下：①ＭＤＳ患者ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ明显低于对照组，ＣＦＵ－Ｅ减低者占３０／３２例，ＣＦＵ－ＧＭ减低者占３１／３２例。②ＩＦＮ－γ对ＭＤＳ患者ＣＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－ＧＭ的促增殖作用与患者自身集落数有关，在自身集落数正常和稍减低者这种作用最明显，在明显减低者这种作用小甚至为０。④上海和日本