EB病毒LMP1通过NF-κB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白I(EBV-LMPl)通过活化NF-κB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基因HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用，为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法：以鼻咽癌细胞为实验模型，将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下，构建LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk/GCV系统，采用同位素方法检测tk活性来研究LMPl通过NF-κB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征，MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果：成功构建受LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk表达质粒，发现其在GCV处理下，表达LMPl的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论：携带有LMPl-HSV-tk细胞对GCV治疗高度敏感，显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

EB病毒感染与致鼻咽癌机制研究进展

Epstein-Barr病毒（EBV）的潜伏感染与鼻咽癌关系密切,在感染人体后长期潜伏,可表达多种基因,其潜伏膜蛋白（LMP）编码基因、EB病毒核抗原（EBNA）基因及EBV编码的小RNA（EBER）可以通过不同的机制致鼻咽癌。其中LMPl基因已被列为癌基因,通过激活转录核因子-κB（NF-κB）、激活蛋白1以及janus蛋白激酶．信号转导子与转录激活子信号传导通路而致瘤。     

微小RNA与鼻咽癌

微小RNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。最新研究发现,miRNA与鼻咽癌中Epstein-Barr病毒(EBV)、潜在的膜蛋白-1(LMP-1)、信号转导通路、肿瘤相关基因网络、细胞有丝分裂、肿瘤血管生成和侵袭转移密切相关。探索miRNA与鼻咽癌发生发展之间的关系,有助于加深对其发病机制的认识,也将为临床诊断和治疗提供新的启示与依据。     

微小RNA与鼻咽癌

微小RNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20 ～ 25个核苷酸.最新研究发现,miRNA与鼻咽癌中Epstein-Barr病毒(EBV)、潜在的膜蛋白-1(LMP-1)、信号转导通路、肿瘤相关基因网络、细胞有丝分裂、肿瘤血管生成和侵袭转移密切相关.探索miRNA与鼻咽癌发生发展之间的关系,有助于加深对其发病机制的认识,也将为临床诊断和治疗提供新的启示与依据.     

三氧化二砷抑制人鼻咽癌细胞侵袭的体外实验研究

 目的 观察三氧化二砷(As₂O₃)对人鼻咽癌细胞株HNEl-LMPl侵袭、转移的影响。方法 鼻咽癌细胞在含3μmol／L的As₂O₃培养基中培养48小时。然后在无含砷的培养基中继续培养48小时后，收集此时间点贴壁的细胞作为研究对象；用细胞-基质黏附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测As₂O₃对HNEl-LMPl细胞黏附、运动及侵袭能力的影响；用激光共聚焦的方法检测EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMPl)的表达情况。结果 肿瘤细胞-基质黏附实验结果显示，经As₂O₃处理的HNEl-LMPl细胞，其黏附能力(平均吸光度为0．524±0．09)低于对照组细胞(平均吸光度为0．665±0．14)，两者相比有差异(P<0．05)。运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭结果均显示，经As₂O₃处理后，穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(PVP-F)的肿瘤细胞数明显减少(P<0.01)，同时As₂O₃能够下调LMPl的表达。结论As₂O₃具有抗人鼻咽癌细胞株转移的潜力，其机制可能与抑制LMPl的表达相关。     

EGCG干预LMPl激活的AP-1信号转导通路

目的 探讨EGCG对鼻咽癌细胞激活蛋白1(AP-1)信号转导通路的干预作用，阐明在鼻咽癌细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl)活化的AP-1信号转导通路中靶分子的机制。方法 采用EB病毒阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1-LMP1细胞。利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察EGCG对CNE1和CNE1-LMP1细胞的生存率的影响。采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对AP-1活性的作用。利用间接免疫荧光法观察EGCG对JNK核移位的影响，再分别提取CNE1和CNE1-LMP1的胞浆及胞核蛋白，Western blot分析EGCG抑制JNK的核移位后，胞浆及胞核蛋白中JNK的变化。采用Western blot分析EGCG对c-Jun的磷酸化水平的影响。采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对cyclinD1启动子活性的影响，并用Western blot分析EGCG对cyclinD1蛋白表达的作用。结果 EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性，并可抑制AP-1的活性。EGCG能抑制JNK的核移位，并抑制c-Jun的磷酸化。EGCG对AP-1信号通路下游的靶基因cyclinD1的启动子活性及其蛋白表达都有抑制作用。结论 EGCG对信号转导通路上的AP-1、JNK、c-Jtm、cyclinD1多个靶点分子具有干预作用。LMP1是EB病毒这种编码的蛋白，因此，EGCG抑制与病毒相联系的信号转导通路，可能是EGCG抑制与病毒相关的肿瘤的分子机制之一。     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导鼻咽癌细胞中转录因子Ets-1表达的实验研究

目的 探讨鼻咽癌(NPC)细胞中EB病毒潜伏膜蛋白1(EMP1)是否可介导转录因子Ets-1的表达。方法 采用受四环素(Dox)调控的、LMP1表达的NPC细胞系(pTet-on-LMP1 HNE2),用Dox诱导LMP1表达,并检测Ets-1的表达。采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测Ets-1 RNA水平的变化;应用Western blot方法检测Ets-1蛋白质表达情况;应用免疫共沉淀和Western blot方法检测Ets-1磷酸化水平;应用EMSA方法检测Ets-1的DNA结合活性。结果 在不同诱导时间、不同浓度Dox诱导的pTet-on-LMP1 HNE2细胞中,LMPl表达与Ets-1 RNA表达、蛋白质表达、苏氨酸磷酸化水平及DNA结合活性在一定范围内呈正相关。结论 IMP1可介导NPC细胞中Ets-1的转录活化和表达,可能是LMP1致瘤的新机制。     

鼻咽癌中EB病毒潜伏膜蛋白1对p53表达的调控

目的 探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）是否通过NF-kB在鼻咽癌细胞中促进p53蛋白的表达,为阐明LMP1促进细胞凋亡的机制提供实验依据。方法 利用四环素诱导表达系统,建立受四环素调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系,用报道基因检测法和Western印迹技术,观察LMP1过量表达对NF-kB的功能性活化及p53、bcl-2表达的影响。结果 在鼻咽癌细胞中,LMP1能活化NF-kB。过量表达的LMP1促进p53基因的表达,这种促表达可以被硫代磷酸化修饰的LMP1及p65反义寡聚脱氧核苷酸阻断,LMP1和p65地bcl-2的表达则没有影响,LMP1过表达对bcl-2的表达无影响。结论 鼻咽癌中LMP1通过活化核转录因子NF-kB调节p53的表达;而在LMP1过表达时,bcl-2介导的抗凋亡机制未被启动,至少是未被上调的。     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响

背景与目的:已证实EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)能够诱导鼻咽癌细胞中基质金属蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)的表达。本实验的目的是观察EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞转移相关因素的影响,探讨LMP1在鼻咽癌侵袭、转移过程中的作用。方法:用免疫组化法及Westernblot法检测CNE1-GL(转染LMP1基因的CNE1细胞)和CNE1细胞中MMP-9的表达情况;用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验和肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验检测LMP1对CNE1细胞粘附、运动及侵袭能力的影响。结果:免疫组化法及Westernblot法结果均显示CNE1-GL细胞中MMP-9的表达明显高于CNE1细胞(P<0.05);肿瘤细胞-基质粘附实验结果显示,CNE1-GL的粘附能力(平均吸光度值为1.2508±0.0711),高于CNE1细胞(平均吸光度值为0.9519±0.068),两者相比差异有显著性(P<0.01)。运动实验及重组基底膜侵袭实验结果均显示,穿过游离的聚乙烯吡咯烷酮膜(polyvinylpyrroli-done-free,PVP-F)的CNE1-GL细胞数明显高于CNE1细胞(P<0.01)。结论:LMP1能够诱导CNE1细胞中MMP-9的表达,且增强CNE1细胞与基底膜的粘附能力、运动能力及侵袭能力。     

EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响

背景与目的:EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌的浸润和转移过程中起重要的作用。本实验目的在于研究EB病毒LMP1对人鼻咽癌细胞转移能力的影响和探讨其中的相关机制。方法:应用免疫细胞化学RT-PCR法和Western blot检测LMP1、E-cadherin和intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)在人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和转染了LMP1基因的CNE1-GL细胞中的表达。应用细胞-细胞粘附实验、细胞-基质粘附实验、划痕实验和细胞运动实验观察LMP1对鼻咽癌细胞粘附和运动能力的影响。结果:免疫细胞化学结果显示:LMP1在CNE1和CNE1-GL细胞中的阳性率分别为0和(96.60±3.03)%(P<0.01);E-cadherin蛋白的阳性率分别为(37.47±1.50)%和(19.53±1.92)%(P<0.01);ICAM-1蛋白的阳性率分别为(5.27±1.45)%和(93.33±4.23)%(P<0.01)。RT-PCR和Westernblot结果表明,与CNE1细胞相比较,CNE1-GL细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),而ICAM-1的mRNA和蛋白表达则明显升高(P<0.01)。肿瘤细胞同质粘附实验显示,CNE1-GL细胞的同质粘附能力较CNE1细胞弱(P<0.05)。肿瘤细胞-基质粘附实验得出CNE1-GL细胞的异质粘附能力(A值=0.60±0.03)较CNE1细胞(A值=0.46±0.01)强(P<0.01)。肿瘤细胞运动实验显示,穿过PVPF膜的CNE1-GL细胞数多于CNE1细胞(119.3±6.0 vs 46.3±7.0,P<0.05)。结论:LMP1通过抑制E-cadherin表达、促进ICAM-1表达从而抑制肿瘤细胞的同质粘附能力、增强其异质粘附能力和运动能力来参与鼻咽癌的侵袭和转移。     

EBV-LMP1上调Ezrin表达对鼻咽癌细胞转移潜能的影响

背景与目的:细胞骨架相关蛋白Ezrin的异常表达与肿瘤侵袭转移密切相关,既往研究已证实EB病毒潜伏膜蛋白1(Epstein-Barr virus latent membrane protein1,EBV-LMP1)可促进鼻咽癌细胞的转移能力。本研究旨在进一步探讨EBV-LMP1是否通过改变Ezrin的表达来影响鼻咽癌细胞的转移能力。方法:采用免疫细胞化学和Western blot检测两种鼻咽癌细胞株-CNE1细胞(EBV阴性)和CNE1-GL细胞(稳定转染EBV-LMP1)中LMP1和Ezrin的表达;细胞-基质粘附实验检测CNE1、CNE1-GL和经Ezrin抗体预处理的CNE1-GL细胞(AntiEzrin-CNE1-GL)对细胞外基质的粘附力;Transwell小室法检测上述3种细胞的运动和对重组基底膜侵袭能力。结果:CNE1细胞中Ezrin阴性表达,而CNE1-GL细胞中Ezrin强阳性表达。CNE1-GL细胞对细胞外基质的粘附率[(89.38±6.12)%]强于CNE1细胞[(49.42±5.37)%](P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞对基质的粘附率[(56.94±4.08)%]明显下降,与CNE1-GL相比,差异有统计学意义(P<0.05)。运动实验和侵袭实验均提示CNE1-GL细胞运动、侵袭能力(107±11和179±25)强于CNE1细胞(27±3和46±6),差异均有统计学意义(P<0.001),而AntiEzrin-CNE1-GL细胞的运动、侵袭能力(38±4和51±5)较CNE1-GL细胞显均显著下降(P<0.001)。结论:CNE1细胞中EBV-LMP1可通过上调Ezrin表达来促进细胞转移。     

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP 1的表达

目的：探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况。方法：用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况。结果：免疫组化及Western bolt法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达。结论：人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关。     

EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响

背景与目的:已证实EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein,LMP1)具有转化致瘤作用,在鼻咽癌的发生发展中起重要作用。LMP1的转化致瘤作用可能与细胞凋亡有关,本实验目的是观察EBV-LMP1对鼻咽癌细胞系CNE1细胞凋亡的影响,探索LMP1在鼻咽癌发生发展中的可能机制。方法:用电转染的方法将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,用荧光显微镜检测报道基因GFP的表达情况;用免疫组化法及Westernblot法检测目的基因LMP1的表达情况;用流式细胞仪、荧光染色及DNA片段分析等方法检测在有地塞米松磷酸钠或无血清饥饿诱导的情况下LMP1对CNE1细胞凋亡的影响。结果:CNE1G细胞(转染空载质粒PAT-GFP的CNE1细胞)及CNE1GL(转染目的基因质粒PAT-GFP-LMP1的CNE1细胞)有绿色荧光蛋白表达,CNE1细胞(未经转染的CNE1细胞)无绿色荧光蛋白表达;CNE1GL细胞LMP1呈阳性表达,而CNE1及CNE1G细胞均为阴性。CNE1、CNE1G及CNE1GL3组细胞分别用地塞米松磷酸钠或无血清1640培养液处理后均有凋亡出现,且两种诱导方法均能使CNE1GL组细胞的凋亡指数(apoptosisindex,AI)较CNE1及CNE1G组明显增高(P<0.05),而CNE1与CNE1G组的凋亡指数无明显差别。3组细胞常规培养下则无凋亡出现。结论:LMP1基因成功导入CNE1细胞     

EBV‐encoded LMP1 regulates Op18/stathmin signaling pathway by cdc2 mediation in nasopharyngeal carcinoma cells

Oncoprotein 18/stathmin (Op18/stathmin) plays a crucial role in maintaining cell biological characteristics by regulating microtubule dynamics, especially entry into mitosis; phosphorylated Op18/stathmin promotes microtubule polymerization to form the mitotic spindle, which is essential for chromosome segregation and cell division. Cdc2 is a critical kinase in starting M phase events in cell‐cycle progression and is a positive regulator of the cell cycle. Latent membrane protein 1 (LMP1) is an Epstein‐Barr virus (EBV)‐encoded oncogenic protein that is able to induce carcinogenesis via various signaling pathways. This study focused on regulation by LMP1 of Op18/stathmin signaling in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells and showed that LMP1 regulates Op18/stathmin signaling through cdc2 mediation, LMP1 upregulates cdc2 kinase activity, and Op18/stathmin phosphorylation promotes the interaction of cdc2 with Op18/stathmin and microtubule polymerization during mitosis, and inhibition of LMP1 expression attenuates the interaction of cdc2 and Op18/stathmin and promotes microtubule depolymerization. These results reveal a new pathway via which LMP1 regulates Op18/stathmin signaling by cdc2 mediation; this new signaling pathway not only perfects the LMP1 regulation network but also elucidates the molecular mechanism of LMP1 that leads to carcinogenesis. © 2008 Wiley‐Liss, Inc.     

定量研究EB病毒潜在膜蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE1的作用

目的研究ＥＢ病毒ＬＭＰ对人高分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１细胞形态及ＤＮＡ含量的影响。方法采用电穿孔基因转染技术，将重组ＥＢＶ┐ＬＭＰ表达质粒转染鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１细胞。以载体质粒转染及ＣＮＥ１细胞为对照，用免疫荧光和图像分析方法，观察细胞ＬＭＰ表达、细胞形态及ＤＮＡ含量的变化。结果ＬＭＰ表达质粒转染后细胞浆及细胞膜ＬＭＰ强阳性表达。形态定量及ＤＮＡ含量测定表明，ＬＭＰ表达后，ＣＮＥ１细胞明显变小（Ｐ＜０．０１），核浆比显著增大（Ｐ＜０．０１），核浆的变化主要由胞浆面积的增减所致，而与核面积的改变则无明显正比关系；ＤＮＡ含量明显增高（Ｐ＜０．０１／０．０５），且倍体分布更分散而右移。结论ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用，可致细胞恶性程度增高且分化受抑，有向低分化鳞癌发展倾向，提示ＬＭＰ在ＮＰＣ的发生发展过程及其演进中可能起重要作用     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）对人高分化鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响。方法采用电穿孔基因转染技术。将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,以载体质粒转染及CNE1细胞为对照组,用免疫组化检测LMP1蛋白的表达;用细胞体外增殖实验检测细胞OD比值;用裸小鼠成瘤实验观察移植瘤体积倍增时间和生长率。结果内动物实验细胞移植后CNE1GL组潜伏期缩短,第7、8、9周时,其平均肿瘤体积生长显著高于对照组（P〈0.05）;体外细胞增殖实验3组细胞OD比值差异无显著性（P〉0.05）。结论EBV-LMP1对CNE1细胞的体内增殖能力可能有促进作用。