中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

浙龟甲的PCR鉴别研究

目的 建立聚合酶链式反应（PCR）技术鉴别浙龟甲[来源为龟黄喉水龟Clemmys mutica（Cantor）的背甲及腹甲]真伪的方法。方法 提取浙龟甲及其混淆品的基因组DNA,从NCBI网站上检索黄喉水龟及其混淆品的线粒体基因,进行分析比对,根据黄喉水龟细胞色素b（cytochrome b gene,Cytb）基因上的特异位点应用Oligo软件设计引物,对浙龟甲及其混淆品样本进行PCR扩增。结果 所设计的引物能特异性扩增黄喉水龟,扩增片段长度为357 bp,能有效区分浙龟甲及其混淆品种。结论 建立的PCR技术鉴别浙龟甲方法,具有特异性高、方法简便快捷、实用性较强的特点,在快速准确鉴别浙龟甲方面具有良好的应用前景。     

海马类药材的分子遗传标记鉴定研究

应用古DNA研究技术从5种海马药材中提取DNA,用PCR技术扩增约450bp的12SrRNA基因片段和约490 bp的细胞色素b基因片段。对扩增产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析和DNA序列分析。用RFLP分析方法可以鉴别2种海马,用DNA序列分析方法得到的分子遗传标记可以鉴别所有5种海马。对其它动物类药材的鉴定有一定参考价值。     

5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性中的可行性研究

目的探讨5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性研究中的可行性。方法提取不同产地穿心莲总DNA后,PCR特异扩增5SrRNA基因间隔区,采用荧光标记末端终止子双脱氧末端终止法测序,对测序结果进行多序列联配分析。结果成功得到321bp的5SrRNA基因间隔区碱基序列,经过多序列联配分析发现,不同产地穿心莲的此段5SrRNA基因间隔区DNA序列之间没有差异。结论5SrRNA基因间隔区DNA序列不适合用于研究穿心莲药材的道地性。     

应用线粒体12srRNA和COX-1基因进行种属鉴定

目的以线粒体DNA为目标序列,探讨生物检材的种属来源问题。方法收集人和7种动物的血液或肌肉组织样本,提取DNA定量后,复合扩增线粒体12srRNA和COX-1基因片段,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物谱带。结果人类DNA扩增产物分别为436 bp、277 bp两条谱带,而鼠、鸡、猪、兔、猫、狗、羊的扩增产物仅有一条谱带,430～450 bp,即动物基于COX-1基因片段无扩增产物。结论复合扩增线粒体12srRNA和COX-1两基因片段进行种属鉴定,方法简单,灵敏度较高,可应用于法医学实践。     

儿童近端小肠粘膜相关菌群分布研究

目的研究儿童近端小肠粘膜相关菌群种类和分布。方法取儿童近端小肠粘膜活检组织,提取总DNA,经PCR扩增后对16SrRNA基因扩增片段克隆,并对克隆片段进行DNA序列测定,根据序列结果分析细菌组成。同时在不同培养条件下进行细菌培养及鉴定。结果16SrRNA基因测序结果表明儿童近端小肠粘膜相关菌群包括6个细菌门类,厚壁菌门、变形菌门和放线菌门占总细菌的88.8%;拟杆菌门、梭杆菌门和TM7占11.2%。链球菌属和奈瑟菌属为儿童近端小肠粘膜相关菌群的主要菌属;韦荣菌属、孪生菌属、放线菌属、罗氏球菌属、嗜血菌属、普雷沃菌属和颗粒链菌属占较高比例。细菌培养结果与16SrRNA基因测序结果类似。结论儿童近端小肠粘膜具有独特的菌群定殖分布。     

射干及类似药用植物叶绿体rbcL基因序列分析

目的 对射干Belamcanda chinensis (L.) DC.,鸢尾Iris tectorum Maxim.,野鸢尾I.dichotoma Pall.,蝴蝶花I.japonica Thunb.和德国鸢尾I.germaica L.等5种药用植物进行叶绿体rbcL基因序列分析,并对其亲缘关系进行探讨。方法CTAB(Cetyl trimelhyl ammonium bromide,CTAB)法提取总DNA,用作者设计的引物对鸢尾科5种药用植物的叶绿体rbcL(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylose Large Gene,rbcL)基因进行扩增,PCR扩增产物纯化后,用ABI310 DNA自动测序仪测序。结果获得射干和4种鸢尾属药用植物叶绿体rbcL基因部分序列(约750 bp),除德国鸢尾外, 其余4种药用植物的rbcL基因序列为首次获得;用clustal 8.0,MEGA 2.0等软件分析统计获得的目的基因片段,得到碱基突变点,遗传距离［碱基差异数(1.000～20.000)、颠换数为(0.000～9.000)、转换数为(0.000～14.000)］,根据rbcL基因部分序列数据建立分子系统树。结论根据叶绿体rbcL基因序列数据可以很好的鉴别5种鸢尾科植物。     

基于DNA条形码ITS2序列对阿魏属药用植物的鉴别研究

目的:建立一种快速、准确和标准化的中药材阿魏属植物DNA条形码鉴别方法。方法:提取新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)和阜康阿魏(Ferula fukanensis K.M.Shen)基因组DNA,扩增ITS2序列并测序;运用分析相似性搜索法,下载Gen Bank数据库中阿魏属植物13个物种26个样本基因ITS2序列并进行比对分析,计算种间种内遗传距离并构建系统进化树进行聚类分析。结果:通过计算,15个物种遗传距离分布范围为0.009~0.230,平均遗传距离为0.018;聚类分析结果显示DNA条形码ITS2序列能够将阿魏属32种植物聚为不同的类。结论:建立的阿魏药材DNA条形码ITS2序列鉴别方法可准确、快速地鉴别出阿魏属药材的正品和混淆品。     

中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究

目的　运用分子标记技术鉴定药材蛇胆的真伪,以克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足。方法　分别从药材蛇胆的胆衣和胆汁、原动物棕黑锦蛇的肌肉和胆汁中提取DNA,经PCR扩增得到约400bp的12SrRNA基因片段,并对该基因片段进行测序研究。结果　从少量药材蛇胆的胆衣和胆汁中可提得足够用于PCR扩增的DNA模板,扩增产物的测序结果表明同一动物的胆衣和胆汁、肌肉和胆汁的碱基序列完全一致。结论　DNA分子标记技术可用于中药材蛇胆和胆汁的鉴定,提示该技术也可用于其他动物分泌物类型药材的鉴别。目前市场上药材蛇胆来源较复杂,需加强质量监督和控制。     

基于DNA条形码技术鉴定蒙药材刺柏叶及其混淆品

目的：基于DNA条形码技术鉴别蒙药材刺柏叶及其混淆品。方法：采用国际通用的条形码序列 ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL,对刺柏叶及其混淆品圆柏叶共计11份样品进行DNA提取、扩增,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,并用MEGA软件对拼接序列进行变异位点分析、邻接(NJ)聚类分析,并计算其平均种内、种间遗传距离。结果：4对引物的PCR扩增产物测序成功率分别为ITS2 100%、 psbA-trnH 100%、rbcL 100%、matK 0%;ITS2序列和psbA-trnH序列均可通过变异位点比较区分刺柏叶及其混淆品;NJ聚类分析的结果显示,psbA-trnH序列的NJ聚类树中刺柏叶与圆柏叶均能分别聚为一支,且psbA-trnH序列的平均种间遗传距离明显大于平均种内遗传距离。结论：psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶,可作为鉴别刺柏叶及其混淆品圆柏叶的条形码序列,为蒙药材刺柏叶及其混淆品的鉴别提供支持。     

Authentication of Chinese crude drug, Gecko, by allele-specific diagnostic PCR.

Based on the sequences of the mitochondrial 12S rRNA gene fragment of 17 samples from Gekkonidae, Salamandridae, Agamidae and Hynobiidae, respectively, a pair of allele-specific primers was designed for differentiating the Chinese medicinal material Gecko from its adulterants by PCR. The results of amplification with the primers indicate that amplicons from the templates of Gekko gecko were clearly revealed by agarose gel electrophoresis, whereas no evident amplicons were found from other species. The primers were employed to identify crude drug samples from different sources. Among a total of 9 samples, 3 were diagnosed as genuine Gecko. This result is consistent with morphological identification and DNA sequence analyses.     

Sequence analysis of chloroplast chlB gene of medicinal Ephedra species and its application to authentication of Ephedra Herb

Chloroplast chlB gene encoding subunit B of light-independent protochlorophyllide reductase was amplified from herbarium and crude drug specimens of Ephedra sinica, E. intermedia, E. equisetina, and E. przewalskii. Sequence comparison of the chlB gene indicated that all the E. sinica specimens have the same sequence type (Type S) distinctive from other species, while there are two sequence types (Type E1 and Type E2) in E. equisetina. E. intermedia and E. prezewalskii revealed an identical sequence type (Type IP). E. sinica was also identified by digesting the chlB fragment with Bcl I. A novel method for DNA authentication of Ephedra Herb based on the sequences of the chloroplast chlB gene and internal transcribed spacer of nuclear rRNA genes was developed and successfully applied for identification of the crude drugs obtained in the Chinese market.     

基于COⅠ与16S rRNA基因对广地龙的DNA分子鉴定研究

目的:建立一种快速、准确和标准化的广地龙DNA分子标记鉴别方法。方法:测定了5个不同居群广地龙的线粒体细胞色素酶亚单位(CO)Ⅰ和16S rRNA基因序列,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,通过下载GenBank地龙原动物的COⅠ与16S rRNA序列,采用MEGA4.1计算广地龙及其伪品地龙的种内、种间的K2P遗传距离,并基于K2P模型构建NJ和MP树。结果:COⅠ变异位点、信息位点均高于16SrRNA,COⅠ基因无插入和缺失,16S rRNA存在4个插入和缺失。COⅠ和16S rRNA序列种间遗传距离均明显大于种内,COⅠ和16S rRNA基因均能将广地龙从其他地龙或蚯蚓物种鉴别开来。结论:获得的广地龙COⅠ和16S rRNA序列可为动物性中药材地龙的分子水平鉴定提供参考,为动物性中药材DNA条形码数据库积累了相关信息数据。     

地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的  建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus, HaPyV）PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法  设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus, MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测。结果  仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV 的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论  建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。     

PCR快速鉴定actinobacteria三种模板制备方法的比较

目的 本研究旨在建立准确、简便、快速的放线细菌鉴定技术，为普通和极端环境放线细菌资源的调查和开发利用创造条件。方法 从放线细菌固体培养基上挑取少量菌体，用微波炉法快速制备基因组DNA作为PCR模板，与液体培养法得到的菌体以超声波法或冻融法制备的模板进行了PCR扩增效果的比较研究。结果P CR检测结果表明微波炉法制备的模板可进行有效的体外扩增，目的条带特异，而超声波法或冻融法并不对所有菌株有效，并有非特异扩增产物产生。结论 组合微波炉法快速制备放线细菌基因组DNA技术和23S rRNA特异插入序列PCR扩增技术建立了准确、简便、快速的actinobacteria鉴别体系。     

多形类杆菌的分子生物学鉴定

目的用聚合酶连反应技术(PCR)鉴定多形类杆菌。方法采用16S rRNA基因序列为靶基因设计引物,建立PCR反应体系对该种细菌进行鉴定,并测定PCR产物序列,验证PCR反应的特异性。结果3株多形类杆菌能被扩增,其他菌株和基因组不能被扩增;所测得的PCR产物序列和标准的多形类杆菌16S rRNA基因序列99%同源。结论建立PCR反应体系能特异地鉴定多形类杆菌。     

基因测序技术在中药质量研究中的应用（Ⅰ）——山东郓城猴头半夏基原的DNA测序鉴别

目的：分析半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.及其伪品虎常南星Pinellia pedatisecta Schott的核基因组序列,为半夏正品基原鉴别提供分子依据。方法：采用PCR直接测序技术测定半夏及其伪品的18S rRNA基因核苷酸序列并作序列变异和选择性内切酶谱（PCR－SR）分析。结果：半夏和伪品的18S rRNA序列长度均为1805bp,根据排序比较,半夏原植物与商品药材间的序列完全相同,虎掌南星亦如此。而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序列差异（有4个变异位点）。在半夏18S rRNA序列中有一个限制性内切酶Ase Ⅰ识别位点,通过PCR－SR图谱显示800bp和900bp2个酶切片断,而虎掌南星则无此位点,PCR－SR图谱显示1个未消化的1800bp片断。结论：通过核基因组序列和PCR－SR图谱差异DNA测序技术可成为半夏正品基原鉴别准确而有效的分子方法。