人乳头状瘤病毒E6、E7原癌蛋白致癌的机制

高危型人乳头状瘤病毒E6、E7基因编码的原癌蛋白是导致宫颈癌的重要原因，其致癌机制主要与p53,pRb有关，还与端粒酶激活、干扰素调控因子3、E6靶蛋白1、p21、组蛋白脱乙酰脂酶以及凋亡有关。     

p27与cyclin E蛋白在宫颈鳞癌中的表达及临床意义

目的研究细胞周期相关蛋白p27与cyclin E在宫颈鳞癌中的表达及其与组织学分级、临床分期及预后的关系.方法应用SP免疫组化法检测54例宫颈鳞癌中p27和cyclin E蛋白的表达,分析它们的阳性表达与肿瘤的组织学分级、临床分期及预后的关系.结果 P27蛋白在宫颈鳞癌中呈低表达,且与组织学分级和预后有关;而cyclin E蛋白在宫颈鳞癌中呈高表达,且与临床分期和预后有关.两者在肿瘤中的表达呈负相关.低p27、高cyclin E表达预示患者有一个不良的预后.结论 p27和cyclin E蛋白与宫颈鳞癌的发生、发展有关.p27与分化有关,cyclin E与病程进展有关,二者均可作为临床判定预后的指标.     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

人乳头瘤病毒E2蛋白结构和功能研究进展

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是导致宫颈癌的主要原因。HPV E2蛋白在病毒的转录和复制调节中起着重要的作用。其主要由氨基端转录活化结构域、羧基端DNA结合域以及可变的铰链区组成。HPV E2基因的突变或整合和致癌机制有关。HPV E2蛋白能抑制E6和E7蛋白表达,HPV整合常在E2基因处发生断裂缺失,而E2基因的缺失导致E6和E7蛋白的过表达。就有关HPV E2蛋白的结构和功能的研究进展综述,为HPV E2蛋白在致癌机制中作用的研究提供理论基础。     

p16蛋白和E-钙粘附蛋白在子宫颈癌中的表达及临床意义

目的　探讨p1 6蛋白及E -钙粘附蛋白 (E -cad)在子宫颈癌中的表达及临床意义。方法　采用单克隆抗体SP免疫组化技术对 5 4例子宫颈癌和 2 0例正常宫颈组织进行p1 6蛋白和E -Cad表达的检测。结果①p1 6蛋白和E -Cad在子宫颈癌和正常宫颈组织中的表达差异有极显著性 ;②p1 6蛋白的表达与子宫颈癌的病理分级和临床分期无显著关联 ,与宫颈癌盆腔淋巴结转移有关 ;③E -Cad的表达与子宫颈癌的病理分级和盆腔淋巴结转移有关 ,但与临床分期无关。结论　p1 6蛋白和E -cad的表达与宫颈癌的发生和进展有一定的相关性 ,p1 6蛋白和E -cad的表达降低或缺失在子宫颈癌的发展过程中有协同作用。检验p1 6蛋白和E -cad的表达可以作为判定子宫颈癌恶性程度的指标之一 ,并为正确估计宫颈癌患者的预后提供依据     

人乳头状瘤病毒16型E6基因的小分子干扰RNA对子宫颈癌细胞生长的影响

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤。研究发现，人乳头状瘤病毒（HPV）是本病发生的一个重要病毒性致癌因子。大约80％的宫颈癌可检测到HPV16，其E6基因是致癌的关键基因，绝大多数宫颈癌HPV16、18E6癌蛋白通过泛素依赖的途径与p53蛋白结合，导致p53蛋白降解，致使细胞无限增殖。所以直接针对HPVE6基因的治疗可为宫颈癌患者提供有效的治疗方法。     

宫颈癌及其癌前病变组织中FHIT蛋白异常表达与HPV16E6、HPV16E7蛋白表达的相关性

目的 探讨宫颈癌中三联脆组(FHIT)蛋白表达与HPV16 E6、E7蛋白表达的相关性.方法 采用免疫组化SP法对四川大学华西第二医院1999年1月至2003年2月的15例正常宫颈、25例宫颈上皮内瘤变(CIN)以及61例浸润性宫颈鳞癌组织标本进行FHIT蛋白、HPV16E6、HPV16 E7蛋白表达的检测.结果 (1)在正常宫颈上皮、CINI～II、CINⅢ及浸润性宫颈鳞癌中,FHIT 蛋白阳性表达率分别为100%(15/15)、71.43%(10/14)、36.36%(4/11)、14.75%(9/61),P＜0.05;HPV16E6蛋白阳性表达率分剐为0(0/15)、7.14%(1/14)、36.36%(4/11)、59.02%(36/61),P＜0.05;HPV16E7蛋白阳性表达率分别为20.00%(3/15)、42.86%(6/14)、63.64%(7/11)、57.38%(35/61),P＞0.05.(2) 宫颈病变组织中FHIT蛋白的阳性表达与HPV16E6蛋白阳性表达呈负相关(P＜0.0l,r=-0.449),与HPV16E7蛋白表达无相关性(P＞0.05).结论 宫颈癌中FHIT 蛋白的异常表达与HPV16 E6蛋白表达有关,FHIT蛋白和HPV16E6蛋白的联合检测可能可作为宫颈癌前病变转归的指标.     

HPV E6/E7mRNA原位杂交技术在HPV分型检测阴性的子宫颈腺癌中的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒(HPV)分型检测阴性的子宫颈腺癌中HPV E6/E7mRNA的表达情况,为子宫颈腺癌的早期筛查提供新思路。方法:选择2019年1月至2021年6月于潍坊医学院附属医院和山东大学齐鲁医院就诊的HPV分型检测阴性的15例子宫颈腺癌患者为研究组,同期HPV分型检测阳性的15例子宫颈腺癌患者为对照组。采用高危型HPV E6/E7mRNA原位杂交(RISH)检测两组患者病变组织中HPV E6/E7mRNA的表达情况,同时采用免疫组化法(IHC)检测p16和Ki-67的表达情况。结果:与对照组比较,研究组HPV E6/E7 mRNA的阳性表达(73.3%vs.100.0%)、p16的阳性表达(80.0%vs.100.0%)及Ki-67的阳性表达(86.7%vs.100.0%),差异均无统计学意义(P>0.05)。研究组中HPV E6/E7mRNA表达阴性的4例患者病理类型均属于非HPV相关子宫颈腺癌(胃型腺癌2例,微偏腺癌2例),HPV E6/E7mRNA在HPV相关和非HPV相关中的阳性占比分别为100.0%(26/26)和0(0/4);其中1例普通浸润型腺癌HPV...     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

宫颈癌细胞株Hela中CSN6对E6-AP及p53的调节及其分子机制

目的:探讨宫颈癌细胞株Hela中组成型光形态发生因子9信号复合体6(CSN6)对E6-AP及其目标蛋白p53的调节及其分子机制。方法:重组慢病毒干扰载体质粒转染Hela细胞,降调CSN6表达。Western blot法检测E6-AP表达,实时荧光定量PCR检测p53下游基因表达变化。分别将蛋白酶抑制剂MG132、真核生物蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和高表达CSN6的Flag-CSN6质粒分别作用于Hela细胞,Western blot法检测E6-AP蛋白表达。将重组慢病毒质粒shRAN CSN6转染Hela细胞48h后,泛素化检测分析CSN6调节E6-AP蛋白表达的分子机制。试验组裸鼠皮下接种shRNA-CSN6细胞株,对照组接种shRNA-vector细胞株,观察肿瘤体积变化。结果:放线菌酮(CHX)可下调E6AP表达,抑制CSN6表达后E6-AP下调更显著;MG132可使E6AP表达增加,CSN6可加强该作用;抑制CSN6表达后,Hela细胞和裸鼠肿瘤组织中p53下游相关基因表达增加,裸鼠肿瘤生长缓慢。泛素化检测提示,CSN6可抑制E6-AP蛋白的泛素化水解,并呈剂量依赖性。结论:宫颈癌细胞株Hela中CSN6上调E6AP是通过抑制E6-AP蛋白的泛素化水解,稳定其在细胞中的表达,实现对p53的持续降解。     

人乳头瘤病毒E5的研究进展

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,宫颈疾病与人乳头瘤病毒相关。人乳头瘤病毒E5、E6、E7是重要的致癌蛋白,E5多在疾病早期表达,深入探讨人乳头瘤病毒E5的致病机制将为治疗相关宫颈疾病提供契机,并为开发治疗性宫颈癌疫苗提供新思路。     

HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67检测在ASCUS中的诊断价值

目的:探讨HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67检测在宫颈细胞学检查为意义不明确的不典型鳞状细胞(ASCUS)中的诊断价值。方法:回顾分析2015年12月至2017年5月在郑州大学第三附属医院就诊的液基薄层细胞学检查(TCT)结果为ASCUS,并行阴道镜下宫颈组织活检的患者200例。应用杂交捕获技术(HC2)和支链DNA技术(b DNA)行HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA检测。免疫组化法检测宫颈组织中p16/Ki67表达。结果:宫颈高级别病变组(包括CIN2,CIN3,宫颈癌,简称CIN2+)中p16/Ki67、HPV E6/E7mRNA的阳性率与炎症/CIN1组比较,差异有统计学意义(χ2=31. 952,P=0. 000;χ2=11.231,P=0.001),且p16/Ki67表达与CIN2+具有一致性(kappa=0.400,P=0.000)。炎症/CIN1组中,HPV E6/E7 mRNA检测与p16/Ki67检测结果间的差异有统计学意义(P=0.000),但在CIN2+中两者差异无统计学意义(P=0.375)。ROC曲线分析p16/Ki67检测、HPV E6/E7 mRNA检测诊断CIN2+的准确性分别为(AUC=0.800,0.625),均高于HPV DNA检测(AUC=0.579)。结论:HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67表达与宫颈高级别病变密切相关,HPV E6/E7 mRNA检测可望代替HPV DNA成为分流ASCUS的一种有效手段,而p16/Ki67与宫颈高级别病变显著一致,可辅助用于ASCUS患者宫颈组织的病理诊断。     

HPV卵黄抗体抑制HPV18 E6基因表达诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的:评估新型HPV卵黄抗体(HPV-IgY)能否对HPV感染引起的宫颈癌起到预防作用。方法:检测宫颈癌细胞系Hela、Caski中HPV18整合基因的表达情况;检测HPV-IgY对宫颈癌细胞系Caski HPV18 E6蛋白表达以及细胞增殖和凋亡的影响;Western blot法检测p53蛋白表达;通过RNAi技术检测干扰p53后HPV-IgY对Caski细胞增殖和凋亡的影响。结果:宫颈癌Hela、Caski细胞系中HPV18的E6 mRNA和蛋白表达明显高于正常宫颈上皮细胞系HcerEpic。HPV-IgY能明显抑制Caski细胞系的增殖、促进其凋亡,并降低细胞内E6 mRNA和蛋白的表达,促进p53表达。干扰Caski细胞p53后,HPV-IgY对Caski细胞抑制作用减弱。结论:HPV卵黄抗体(HPV-IgY)有明显的抑癌活性,有望成为抗HPV感染及预防宫颈癌的新型药物。     

腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的　为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法　在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果　在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论　携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 ,可望用于宫颈癌病因学的研究     

宫颈病变中人乳头瘤病毒来源E7蛋白表达及意义研究

目的探讨宫颈病变中人乳头瘤病毒(HPV)来源的E7蛋白表达及其与临床诊断病理级别的相关性。方法选取北京大学第一医院2015—2018年收治的宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈鳞癌患者133例,另选取同期宫颈组织病理结果正常的34例患者为阴性对照。采用免疫组化染色技术检测E7蛋白的细胞表达情况,并与宫颈癌高危型HPV感染替代性标志物p16蛋白做比较。结果 E7蛋白在低度鳞状上皮内病变(LSIL)即CINⅠ中阳性率为63.64%(14/22),而在高度鳞状上皮内病变(HSIL)即CINⅡ、Ⅲ病例中阳性率为91.84%(45/49)和98.18%(54/55),宫颈癌中阳性率为100%(7/7)。p16蛋白阳性率在CINⅠ中为59.09%(13/22),CINⅡ、Ⅲ中分别为93.88%(46/49)和96.36%(53/55)。两者检测结果高度相关(P0.05)。随着宫颈病变程度的增加,E7和p16蛋白的阳性率均显著升高。但E7蛋白表达为片灶状阳性,与p16蛋白的弥漫阳性不同;同时HPV E7蛋白表达水平随CIN级别提升也显著增强。在HSIL及宫颈鳞癌中,E7蛋白阳性强度明显高于LSIL。随着患者年龄增长,E7蛋白的阳性率也呈升高趋势,并且其染色强度也增强。结论 E7癌蛋白的阳性率及其表达强度与宫颈病变程度密切相关,并与年龄有关;E7蛋白有望作为宫颈病变CIN诊断与分级的重要参考指标。     

HPV16 18 E6蛋白在宫颈脱落细胞中的表达研究

目的 探讨人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16和(或)18 E6蛋白在宫颈脱落细胞中的表达与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)及宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)的关系.方法 采用免疫印迹(Western blot)方法检测2003年6月至2005年6月中国医科大学第一附属医院CSCC 30例、CIN 52例和16例正常宫颈脱落细胞中HPV16和(或)18 E6蛋白的表达.结果 在上述各组宫颈脱落细胞中HPV16和(或)18 E6表达阳性率分别76.7%(23/30)、51.9%(27/52)和12.5%(2/16);其中在CSCC宫颈脱落细胞中HPV16和(或)18 E6明显高于正常对照组的表达(P＜0.01);CINⅡ、Ⅲ组的表达也显著高于对照组(P＜0.05),而CINⅠ组与正常对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).结论 宫颈脱落细胞标本存在HPV16和(或)18 E6癌基因的表达.宫颈脱落细胞中HPV16和(或)18 E6癌基因的过度表达与CSCC及CINⅡ、Ⅲ密切相关.     

HPV16 E6E7癌蛋白通过TWEAK/Fn14信号途径对细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨HPV16 E6E7对TWEAK/Fn14信号途径及细胞增殖和凋亡的影响。方法:制备表达HPV16 E6E7的逆转录病毒,感染原代角质形成细胞。用流式细胞仪分析可诱导纤维母细胞生长因子14(Fn14)表达,Real-time RT-PCR和Western blot法检测调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干扰素-γ诱导蛋白10水平(IP10)和肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF2)表达,生物化学法检测Ras GTpase活性,TUNEL检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞增殖。结果:表达HPV16 E6E7的逆转录病毒感染角质形成细胞后,Fn14高表达,RANTES、MCP-1、IP10和TRAF2表达增加,Ras GTpase活性升高。与未感染表达HPV16 E6E7逆转录病毒的细胞比较,表达E6E7感染的角质形成细胞对TNF-α刺激不敏感,细胞增殖显著增加(P0.05)。结论:表达HPV16 E6E7细胞激活TWEAK/Fn14信号途径,从而上调RANTES和TRAF2表达,导致细胞增殖,这可能是高危型HPV的一个致病机制。     

反义HPV16 E6/E7-EGFP重组质粒的构建及其对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用

目的:构建HPV16早期基因E6/E7的反义重组质粒,探讨其对SiHa细胞的促凋亡作用。方法:将HPV16E6/E7基因片段反向克隆于真核表达载体pEGFP-C1并转染SiHa细胞,用RT-PCR方法检测转染后SiHa细胞E6、E7基因mRNA的表达,West-ernblot方法检测转染后E6/E7蛋白的表达,流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率。结果:成功构建携带HPV16E6/E7基因反义片段的真核表达载体,转染该质粒后,SiHa细胞E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;转染后细胞凋亡率为(59.3±11.3)%,明显高于转染空载体组[(9.4±1.8)%]和未转染组[(2.1±0.4)%](P<0.05)。结论:反义HPV16E6/E7基因可下调宫颈癌细胞中E6/E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了实验依据。     

HPV16/18E6蛋白和PKR/p-PKR在宫颈病变的表达及意义

目的:探讨宫颈病变组织HPV16/18感染对蛋白激酶R(PKR)激活的影响及两者在宫颈癌形成、演进过程中的作用和对宫颈癌患者预后的影响。方法:用免疫组化SP法检测HPV16/18型E6蛋白(E6)、PKR、磷酸化型PKR(p-PKR)在63例宫颈癌、114例宫颈上皮内瘤样病变(CINⅠ~Ⅲ)、15例正常宫颈组织的表达。结果:E6蛋白与PKR在各组的阳性表达率与宫颈病变级别呈正相关(P<0.05,P<0.05),E6蛋白与PKR在各组的阳性表达率呈正相关(P<0.05);宫颈癌组PKR阳性表达率明显高于p-PKR(P<0.01);E6、PKR阳性表达率与肿瘤大小有关(P<0.05,P<0.05);宫颈癌患者病情进展与临床分期显著相关(P<0.01),病情进展与E6、p-PKR阳性表达率相关(P<0.05,P<0.05)。结论:HPV16/18感染可阻碍PKR激活,突破机体防御HPV16/18感染的机制,在宫颈癌的发生及演进过程中可能起了重要作用,对宫颈癌患者预后不利;p-PKR能抑制宫颈癌患者病情进展,可能改善其预后。