慢病毒介导KSHV vIL-6基因稳定表达的血管内皮细胞株的建立

目的建立慢病毒介导且稳定表达病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)蛋白的血管内皮细胞株。方法以质粒pvIL-6-Flag为模板,PCR扩增vIL-6基因,克隆至慢病毒载体p3DLV,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T细胞,构建含vIL-6基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染血管内皮细胞EA.hy926,经潮霉素筛选,获得稳定表达细胞株,western blot鉴定vIL-6蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为615 bp的vIL-6基因成功克隆至慢病毒表达载体;重组慢病毒经包装、纯化后测得滴度为1.0×107 TU/mL。重组慢病毒感染EA.hy926细胞,经潮霉素筛选,形成生长形态良好的单克隆细胞株EA.hy926-vIL-6。western blot鉴定该细胞株可稳定表达vIL-6蛋白。结论建立了稳定表达vIL-6的EA.hy926细胞株,为进一步研究vIL-6的生物学功能及致病机制提供了细胞模型。     

抗人白细胞介素31多克隆抗体的制备及活性鉴定

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-31蛋白免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-31多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-31在大肠杆菌中表达，纯化hIL-31重组蛋白，免疫新西兰兔制备抗hIL-31多克隆抗体。Western-blot 鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。荧光定量PCR检测多克隆抗体对IL-31诱导MIP-3β分泌的阻断效应。结果：人IL-31经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30%，纯化后的蛋白纯度高；IL-31重组蛋白免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了效价达1：2560的多克隆抗体，可阻断IL-31刺激的MIP-3β的分泌。结论：原核表达的hIL-31蛋白能刺激家兔产生抗体，其多克隆抗体的效价高，具有阻断IL-31作用的生物学活性。     

Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

TRIM34分子B细胞抗原表位的生物信息学筛选及抗体制备

通过生物信息学软件预测TRIM34蛋白的B细胞抗原表位,制备兔源性抗TRIM34多肽抗体并验证其特异性。音先运用VectorNTI11.5和Lasergene7.1软件,分析TRIM34蛋白的氨基酸序列,筛选出B细胞抗原表位序列。人工合成TRIM34多肽抗原,并在多肽氨基端与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联。免疫新西兰大白兔,制备抗TRIM34多肽抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗TRIM34多肽抗体的效价,并通过蛋白印迹法和激光共聚焦法检测抗体对TRIM34蛋白的特异性识别能力。经ELISA检测,抗TRIM34多肽抗体的效价为1:8000。经蛋白印迹检测,抗TRIM34多肽抗体能特异性识别外源性和内源性TRIM34蛋白,同时该抗TRIM34多肽抗体不能识别TRIM 34旁系同源分子TRIM6、TRIM5和TRIM22。经间接免疫荧光染色并通过激光共聚焦检测,发现抗TRIM34多肽抗体可以用来显示TRIM34蛋白的亚细胞定位情况。本研究利用生物信息学分析,筛选并合成TRIM34蛋白抗原多肽,成功制备特异识别TRIM34蛋白的兔源多肽抗体。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

重组PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体并鉴定。方法纯化获得重组蛋白LukF-PV,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA法测定抗体滴度,Western blotting法鉴定免疫活性。结果成功免疫新西兰白兔获得多抗血清,ELISA测定其效价为1∶103,Western blotting鉴定其能识别重组蛋白和金葡菌PVL蛋白。结论成功制备出重组金黄色葡萄球菌PV-杀白细胞素LukF-PV蛋白多克隆抗体,并进行鉴定,为建立产杀白细胞素的金黄色葡萄球菌的快速、廉价的免疫学检测方法奠定基础。     

NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的原核表达载体,制备兔抗人NGAL多克隆抗体。方法利用DNA重组技术构建原核表达载体pET28a-NGAL,诱导表达NGAL融合蛋白,分离该融合蛋白后,注射入免疫家兔制备多克隆抗体。结果成功获得NGAL,免疫动物所得抗血清效价为1∶4000,该抗体能够识别原核表达的NGAL。结论成功克隆NGAL基因并制备了特异性的兔抗人NGAL多克隆抗体。     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的表达及其多克隆抗体制备

[目的]原核表达戊型肝炎病毒ORF3蛋白,探讨其抗原性,并制备特异性多克隆抗体。[方法]PCR扩增ORF3全长基因,将其克隆到原核表达载体pET32b中,诱导表达目的蛋白,并用戊型肝炎病毒阳性血清鉴定其抗原性。蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,western blot检测抗体特异性。[结果]成功构建原核表达载体pET32b—ORF3,在大肠杆菌中高效表达分子量约为32kDa的融合蛋白,ELISA分析表明其具有良好的抗原性。纯化的表达蛋白制备的多克隆抗体具有较强的特异性,效价达到1：32000。[结论]重组表达蛋白ORF3具有良好的抗原性,可用于戊型肝炎诊断试剂盒研制,制备的多克隆抗体特异性强效价高,为进一步研究戊型肝炎病毒奠定了实验基础。     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

CD26多克隆抗体的制备与鉴定

目的针对CD26酶催化结构域制备多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术以人白细胞mRNA为模板,扩增获取编码CD26催化结构域的基因序列,克隆入原核表达载体PET32a后,转化BL21感受态细菌,经IPTG诱导表达得到his-CD26融合蛋白;亲和层析柱纯化并经Western-blot鉴定后,用此重组蛋白免疫2只新西兰纯种大白兔,获取免疫血清共180 ml,经蛋白A柱纯化及抗原抗体亲和纯化后,采用间接ELISA法检测抗体效价,Western-blot及免疫细胞化学染色进行抗体效价及特异性鉴定。结果构建出PET32a/CD26原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达,经his亲合层析纯化后蛋白量达2.3 mg/ml;制备的多抗血清纯化后效价达256 000,经Western-blot证明能特异性的识别CD26重组蛋白,免疫细胞化学染色显示能特异的结合于H9细胞。结论成功制备了能特异性识别CD26的多克隆抗体。     

铜绿假单胞菌VgrG1a蛋白的原核表达及其人鼠嵌合型单抗的制备与鉴定

目的：探究铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统VgrG1a蛋白的原核表达方法，并制备鼠源性和人鼠嵌合型单克隆抗体为抗铜绿假单胞菌感染提供了研究基础。方法：根据NCBI网站上查找到的VgrG1a序列合成重组质粒pET-21a-VgrG1a，转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）plysS进行诱导。通过免疫沉淀法和酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）对诱导得到的重组蛋白进行表达、纯化和鉴定。用纯化后的VgrG1a重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备鼠源多克隆抗体，并利用ELISA方法测定小鼠血清抗体的效价和特异性。通过P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合小鼠脾细胞制备杂交瘤细胞，再通过有限稀释法获得单克隆细胞。经多次ELISA筛选出能够稳定产出特异性抗体的细胞株。在公司测序后获得单克隆抗体的序列信息，并设计出含有此抗体的质粒，转染Expi293细胞，制备人源化单克隆抗体。结果：结果显示，实验成功构建了VgrG1a重组质粒，经探索在最佳表达诱导条件下（温度16℃，IPTG浓度0.5mM，诱导时间16小时），表达得到了重组蛋白VgrG1a，SDS-PAGE显示72kDa处重组蛋白浓度最高。检测制备的鼠源抗体在稀释到1/640000后效价仍较高，并且与目的蛋白能够能特异性的识别并结合。人鼠嵌合型单克隆抗体8A4F5对抗原VgrG1a亲和力高于鼠源单克隆抗体。结论：以上结果表明，该原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性，利用表达的重组蛋白制备的单克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性，为进一步研究蛋白的结构与功能、研制相关的诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

抗曲霉硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)GliT单克隆抗体(单抗)并进行鉴定。方法取重组烟曲霉TR蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗TR抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA法测定抗体效价,IsoStrip鉴定抗体类、型,用western blot、免疫荧光分析技术和免疫组化染色鉴定单抗的特异性。结果筛选到1株稳定分泌抗TR单抗(Anti-TR1)的杂交瘤细胞,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。ELISA法测定效价为5×105,能够与烟曲霉分泌蛋白及菌丝中天然TR特异性结合,还可与基因重组TR特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单抗与烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌丝均发生反应,是曲霉属特异性的抗体。病理组织免疫组化染色结果显示,该抗体可与曲霉菌丝产生特异性反应。结论获得了1株持续分泌高效价抗曲霉属特异性抗TR单抗的交杂瘤细胞株,为进一步的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌virD4基因的克隆表达及其功能初探

目的研究幽门螺杆菌SBK临床分离株virD4的功能。方法通过T-A克隆获得virD4基因片段;构建pET-28a(+)-virD4原核表达载体,转化入Rosetta工程菌,IPTG诱导表达;KCl染色切胶纯化法获得重组蛋白质,SDS-PAGE法分析鉴定重组蛋白质;纯化的重组蛋白质免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA法检测效价,western blot法分析抗原反应特异性;重组蛋白质与GES-1细胞共培养,检测其对细胞炎症因子的表达及细胞增殖的影响。结果 virD4基因全长为1 728 bp,序列与Shi470菌株的virD4基因同源性较高;成功构建原核表达载体,经诱导及纯化获得相对分子质量为63 000的重组蛋白质;成功免疫小鼠制备多克隆抗体,效价为512 000,抗原抗体反应具有特异性;virD4能诱导GES-1细胞分泌炎症因子和增殖。结论成功克隆并表达virD4基因,制备多克隆抗体,其重组蛋白质能诱导细胞因子分泌及细胞增殖。     

肺炎链球菌SPD1672蛋白EL4功能环的原核表达及多克隆抗血清制备

目的原核表达肺炎链球菌SPD1672蛋白膜外EL4功能环,制备并鉴定其多克隆抗血清。方法生物信息学分析SPD1672蛋白结构功能区,用p Cold TF质粒构建含EL4功能环的原核表达载体,IPTG诱导蛋白质表达后行镍柱纯化。经HRV 3C蛋白酶酶切、鉴定后,免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗血清,间接ELISA鉴定效价,western blot鉴定抗血清与肺炎链球菌D39菌株天然蛋白质的亲合力。结果 EL4环可能为SPD1672蛋白酶活性中心。成功构建p Cold TF-SPD1672EL4原核表达载体,诱导表达后获得纯度大于95%的重组融合目的蛋白质。该蛋白质免疫新西兰大白兔后获得效价达到5.12×106的多克隆抗血清,此抗血清与重组的SPD1672EL4蛋白及肺炎链球菌中天然SPD1672蛋白有较好的亲合力。结论成功获得高纯度的肺炎链球菌SPD1672EL4蛋白及其特异的多克隆抗血清,为进一步对SPD1672蛋白的结构与功能研究奠定了基础。     

IL-31重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人白细胞介素31(IL-31)重组腺病毒Ad-IL-31,为下一步IL-31功能研究奠定基础.方法 以pGEM-T-IL-31为模板扩增IL-31基因,将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架质粒共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-31,经PacⅠ线性化后转染QBI-293A细胞,荧光显微镜下观察细胞内荧光,测定病毒效价,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(western blot)分析细胞内IL-31信使核糖核酸(mRNA)和蛋白质的表达.结果 经双酶切及基因扩增仪鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见500 bp插入片段,测序结果和基因库中的基因序列一致;重组病毒效价为2.6×108 pfu/ml;重组病毒感染后,QBI-293A细胞中有IL-31mRNA和蛋白质表达.结论 成功构建IL-31重组腺病毒载体,并在QBI-293A细胞中表达,为进一步研究IL-31的功能奠定了基础.     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.     

人白细胞介素-29 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-29全长cDNA及其在大肠杆菌中表达,制备抗IL-29多克隆抗体。方法：分离外周血单核细胞;VSV感染后,提取总RNA,通过一步RT-PCR获得IL-29全长cDNA。DNA测序正确后,将IL-29cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a(+)中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆茵进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting鉴定,亲和层析分离纯化得到Mr为23000组氨酸标签重组人IL-29融合蛋白。纯化的IL-29免疫家兔制备抗IL-29多克隆抗体。结果：成功获得人IL-29全长cDNA,并以包涵体形式表达于大肠杆茵中。免疫家兔后获得特异抗IL-29的多克隆抗体。结论：获得rhlL-29细胞因子及其多克隆抗体,为其进一步研究及应用奠定基础。     

Nogo-66多克隆抗体的制备和鉴定

目的 制备抗中枢神经系统（CNS）突起再生抑制因子Nogo胞外段Nogo-66的多克隆抗体，以进行Nogo分子检测和功能研究。方法 采用原核系统表达来源于大鼠的GST-Nogo-66融合蛋白，经纯化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体，采用免疫印迹、免疫组织化学和细胞培养技术对该抗体的特异性及生物学活性进行鉴定。结果 获得了高效价的1：10000兔抗大鼠Nogo-66多克隆抗体，该抗体能够识别原核表达的Nogo分子，大鼠脊髓切片的免疫组织化学结果显示，Nogo分子在神经元和少突胶质细胞中有广泛表达；并能阻断Nogo分子对PC12细胞突起生长的抑制作用，具有一定的生物学活性。结论 制备了能识别天然Nogo分子，并具有良好生物学活性的抗Nogo-66多克隆抗体，为检测Nogo分子和进一步研究其功能提供了有力的工具。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶(Fba1)单克隆抗体,用以研究胞壁蛋白Fba1在侵袭性念珠菌感染(IC)中的致病作用。方法取重组白念珠菌Fba1蛋白免疫BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA测定单克隆抗体的效价,western blot和免疫荧光技术鉴定其特异性,用IsoStrip鉴定其抗体类型。结果筛选到1株稳定分泌抗Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞,抗体类型为IgG2a,轻链为κ型。鉴定结果表明,ELISA效价为1×106,能与念珠菌裂解物中天然Fba1和基因重组Fba1特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单克隆抗体与白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌均发生反应。结论建立了1株持续分泌高效价抗念珠菌属特异性Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究Fba1在IC中的致病作用提供了实验材料。