毛囊黑素细胞酪氨酸酶及相关蛋白1和2等分化标记分子的研究

目的:研究毛囊黑素细胞生物学特性,特别是与黑素合成相关酶蛋白和黑素小体结构蛋白在毛囊中的表达及分布情况。方法:取正常人头皮,采用HMB-45和识别酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)等抗体免疫组化染色黑素细胞,研究毛囊中黑素细胞的分布、形态及TYR、TRP1和TRP2等黑素细胞分化标记分子的表达情况。结果:有功能的黑素细胞位于毛漏斗部基底层和生长期毛母质内接近毛乳头处,毛母质黑素细胞树突计数均值为5.1,高于表皮黑素细胞(P<0.01)。毛髓质中黑素细胞与皮质细胞比值约为1∶4.2,而在基底层基底细胞与黑素细胞之比约为1∶9.7。毛球HMB-45,TYR,TRP1和TRP2阳性,阳性颗粒仅局限于毛皮质和毛髓质内。图像分析结果表明:毛球部黑素细胞HMB-45、TYR、TRP1灰度值低于表皮黑素细胞(P<0.05)、毛球部、毛漏斗部及表皮的黑素细胞TRP2灰度比较差异无显著性(P>0.05)。结论:毛囊中有活性的黑素细胞主要位于毛球和毛漏斗部,它们均表达黑素细胞分化标记抗原gp100、TYR、TRP1和TRP2。而且毛母质黑素细胞前3种分子表达量高于表皮黑素细胞。     

胎儿头皮毛囊的黑素细胞定位及精细结构观察

目的 探讨胎儿毛囊黑素细胞的定位及精细结构。方法 6个月胎儿因宫内发育畸形而引产、死亡后，取其带毛头皮，一部分常规包埋切片，分别用NKI/beteb、HMB-45、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1（TRP1）单抗染色。另一部分无菌处理后，0.1 g/L的胶原酶Ⅱ和胰酶消化获得毛囊细胞，培养并传代后，透射电镜和原子力显微镜观察。结果 胎儿头皮毛囊NKI/beteb阳性细胞位于外根鞘，而在毛球内许多细胞HMB-45、酪氨酸酶、TRP1单抗染色阳性。在毛囊细胞的体外培养中，除去成纤维细胞和角质形成细胞后，可见两种黑素细胞，一种数目极少，色素很多，传代后消失；另一种数目较多，开始无色素，但增殖很快。传第3代后，几乎所有细胞NKI/beteb染色阳性。扫描电镜和原子力显微镜下，多数细胞为双极梭形，偶尔有3个树突。细胞体呈圆形或卵圆形，极突上无明显的分支，其内有少数散在的黑素体。结论 胎儿头皮毛囊外根鞘的黑素细胞推测为成黑素细胞和（或）其子代细胞。在早期的体外培养中，细胞增殖很快，但形态及功能上不成熟。     

毛囊外根鞘NKI/beteb和HMB-45免疫组化及胰酶消化后细胞的电镜观察

目的：研究头皮毛囊外根鞘中无活性黑素细胞的存在部位以及毛囊经胰酶消化的细胞组成。方法：拔取正常头发，琼脂预先包埋后，切片行NKI／beteb和。HMB-45单抗染色。另取毛囊用胰酶消化，收集细胞，在透射镜下进行观察。结果：拔取的正常毛囊外根鞘中存在NKL／beteb阳性细胞，而HMB-45染色阴性。在毛母质中有大量的HMB-45阳性细胞。毛囊经胰酶消化的细胞为有活性的黑素细胞(MC)、无色素性黑素细胞(AMMC)、毛皮质细胞和成纤维细胞。结论：毛囊外根鞘中存在功能和形态不成熟的AMMC。     

1,25二羟基维生素D3对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的实验研究

目的研究1,25二羟基维生素D3(1,25-Dihydroxyvitamin D3,VID)对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)的激活作用。方法以高、中、低3种不同浓度的1,25(OH)2D3作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC,倒置显微镜观察细胞形态的变化,然后收集细胞,测定细胞酪氨酸酶活性和黑素含量,透射电镜观察药物作用前后AMMC内黑素小体的变化,最后通过Western blot方法半定量分析药物作用前后AMMC内酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase related protein-1,TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase relatedprotein-2,TRP-2)表达的变化。结果 VID能增加AMMC内酪氨酸酶活性,促进AMMC生成黑素,电镜结果显示药物作用后的AMMC内出现大量Ⅲ、Ⅳ期黑素小体。Western blot结果显示VID可以促进AMMC中TYR和TRP-1的表达,但对TRP-2的表达无明显影响。结论 VID通过促进黑素生成相关酶TYR和TRP-1的表达激活了AMMC。     

白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究

目的:研究白癜风白斑处黑素细胞分布及酪氨酸酶(TYR)等标记分子的表达情况。方法:对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和HMB-45,以Mias99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱。结果:白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P<0.01),患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性(P>0.05)。皮损处黑素细胞树突减少,平均为3.4个,低于对照组(P<0.05)。残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色。白斑毛囊之间可见黑素细胞散在、呈围管样分布。白斑处阳性细胞HMB-45图像灰度值低于正常着色皮肤(P<0.05),而TRP1高于正常皮肤(P<0.01),TYR与正常皮肤无差异(P>0.05)。结论:白斑处仍然有黑素细胞。残存黑素细胞树突回缩、数目变少,而且黑素细胞中黑素细胞标记分子表达异常。     

维A酸促毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞分化的实验研究

目的：研究维A酸(all-transretinoic acid，ATA)对毛囊无色素黑素细胞（famelanotic melangeytes，AMMC)的激活作用。方法：以高、中、低3种不同浓度的ATA作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC，倒置显微镜观察细胞形态的变化，细胞计数法测定ATA对AMMC增殖率的影响，通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前后AMMC酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1，TRP-1)和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)表达的变化。结果：ATA能抑制AMMC的增殖，并能促进AMMC表达TYR和TRP-1，但对TRP-2的表达没有影响。结论：ATA能够促进AMMC的分化，同时抑制增殖，其抑制机制可能与凋亡有关。     

人毛囊无色素黑素细胞培养方法的改良及色素生成相关酶表达的研究

目的进一步改良人毛囊无色素黑素细胞（amelanotic melanocytes，AMMC）培养的方法，并研究了AMMC内黑素生成相关酶的表达：酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinase related protein-1，TRP—1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinase related protein-1，TRP-2）。方法采用1％分离酶（dispase）消化分离毛囊，选用含干细胞因子（stem cell factor，SCF）、内皮素-3（endothelin-3，ET-3）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast grow factor，bFGF）和霍乱毒素（cholera toxin，CT）的成黑素细胞培养基培养AMMC，同时培养表皮黑素细胞（melanocytes，MC）作为对照，采用免疫组化、多巴染色和透射电镜对细胞进行鉴定，蛋白印记法分析TYR、TRP-1和TRP-2的表达。结果1％分离酶消化24h可以容易获得游离的毛囊，结合我们所用的培养基完全排除了成纤维细胞的污染。所用成黑素细胞培养基促AMMC增殖明显，细胞可传5代以上。免疫组化结果显示，AMMC表达gp100、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、酪氨酸酶相关蛋白-1（tyrosinase related proteifl-1，TRP-1）和酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinase related protein-1，TRP-2），证明培养的细胞为黑素细胞。AMMC的多巴染色呈阴性，并且透射电镜发现AMMC胞质中仅含大量的Ⅰ期、Ⅱ期黑素小体，未见Ⅲ、Ⅳ期黑素小体，因此说明AMMC处于未分化状态。TYR和TRP-1在MC中的表达明显强于AMMC。TRP-2的表达在两种细胞间没有明显差别，进一步说明AMMC与MC具有异质性。结论我们成功培养了完全纯化、快速增殖的AMMC，并且培养的细胞不能生成黑素，生物学性状更接近活体中的状态，其与表皮黑素细胞具有异质性。     

倍他米松对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞激活的试验研究

目的：研究倍他米松（betamethasone，BT）对毛囊无色素黑素细胞（amelanotic melanocytes，AMMC）的激活作用。方法：以高、中、低3种不同浓度的BT作用于培养的人毛囊外毛根鞘AMMC，测定药物作用前后酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活性和黑素生成的变化。通过间接免疫荧光法结合激光共聚焦显微镜半定量分析药物作用前、后AMMC TYR、酪氨酸酶相关蛋白（tyrosinase related protein，TRP）-1和TRP-2表达的变化，透射电镜分析黑素小体在药物作用前后的变化。结果：BT促进了AMMC表达TYR和TRP-1，并且以剂量依赖方式促进TYR活性，诱导黑素生成。AMMC主要含有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期黑素小体，但是BT作用后AMMC含有大量Ⅲ或Ⅳ期黑素小体，并且以Ⅳ期黑素小体为主。结论：BT能够激活AMMC，这可能部分解释了糖皮质激素治疗白癜风的机制。     

毛囊无黑素性黑素细胞的分离和培养

目的：分离和培养毛囊无黑素性黑素细胞，探讨其生物学特性。方法：采用胶原酶V游离毛囊，0．5％分离酶消化婴幼儿包皮。0．05％胰酶和0．53mmol／L乙二胺四乙酸(EDTA)消化游离的毛囊和来自包皮的表皮，分别制备单细胞悬液进行培养。传至第3代，待细胞爬上盖玻片后，分别以NKI／heteb和HMB-45单抗染色。结果：毛囊的培养细胞，绝大多数为双极细胞，增殖较快，被NKI／beteb单抗识别，而HMB-45染色阴性，包皮的黑素细胞染色结果则与之相反．结论：毛囊的外根鞘中存在功能和形态上不成熟的无黑素性黑素细胞(AMMC)、AMMC长期培养的成功，有利于研究AMMC在毛囊生物学中所起的作用。     

色素障碍性皮肤病

20 0 4 0 336　白癜风皮损黑素细胞 HMB- 45、酪氨酸酶及其相关蛋白 1的免疫组化研究 /谭诚 (南京医大一附院皮肤科 )…∥临床皮肤科杂志 .- 2 0 0 3,32(7) .- 376～ 378对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白 1和 HMB- 45 ,以 Mias99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱。结果白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P<0 .0 1) ,患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性 (P >0 .0 5 )。皮损处黑素细胞树突减少 ,平均为 3.4个 ,低于对照组 (P <0 .0 5 )。残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色。白斑毛囊之间…     

A modified method for purifying amelanotic melanocytes from human hair follicles

We describe a modified method for establishing long-term pure cultures of amelanotic melanocytes (AMMC) derived from human hair follicles. Normal human corpse scalp (just after death, 1 h) was transected 1 mm below the epidermis, and hair follicles in the remaining dermis were isolated by a two-step enzyme treatment. Hair follicle cell suspensions were prepared by 0.50% trypsin treatment for 30 min and cultured in an optimized melanoblast proliferation nature mitogen medium. Cells attached to the substratum were mostly amelanotic melanocytic in character with small, bipolar shapes in the early stage; only a few keratinocytes and rare fibroblasts were observed. Keratinocytes were easily removed by differential trypsinization. After the third passage, the proliferating cells were all amelanotic melanocytes as confirmed by immunostaining with polyclonal antibodies to alphaPEP7h, which recognized the tyrosinase protein located on melanosomes and NKI/beteb, which is a pre-melanosomal antigen against synthetic peptides corresponding to the carboxyl termini of human melanosomal protein GP100. Cultured AMMC were highly positive to L-dopa reactivity after the addition of IBMX to the culture medium for 7 days. Many stage I and II melanosomes and occasional stage III melanosomes without stage IV melanosomes were found in the cytoplasm by transmission electron microscope. This modified technique is potentially more suitable for cultivating amelanotic melanocytes. The availability of pure cultures of hair-follicle amelanotic melanocytes will facilitate investigations of the roles of those cells in migration and differentiation during treatment of vitiligo.     

中药菟丝子水提取物促毛囊无色素黑素细胞分化的实验研究

目的观察中药菟丝子水提取物诱导毛囊无色素黑素细胞(amelanotic melanocytes,AMMC)分化的作用。方法以8-甲氧补骨脂素(8-MOP)作为阳性对照,选择系列浓度的中药菟丝子水提取物和8-MOP作用于体外培养的AMMC,然后测定酪氨酸酶活性、黑素含量和细胞增殖率的变化。透射电镜观察药物作用前后AMMC超微结构的变化。结果菟丝子水提取物明显促进AMMC生成黑素(P<0.01),且呈浓度依赖性,但是促进作用弱于阳性对照8-MOP(P<0.01)。电镜结果显示,无药物作用的AMMC主要含有I,II和III期黑素小体,药物作用以后,AMMC内出现了大量的IV期黑素小体。菟丝子水提取物对细胞增殖无明显影响,但明显增强酪氨酸酶的活性。结论菟丝子水提取物促进了AM-MC的分化,这种作用与其增强酪氨酸酶活性有关。     

Presence of amelanotic melanocytes within the outer root sheath in senile white hair.

In order to determine whether amelanotic melanocytes are present in senile white hair, we attempted to detect tyrosinase mRNA and its protein using in situ hybridization and immunohistochemical staining. Specifically stained cells containing tyrosinase mRNA or its protein were detected by each technique in 7/23 (30.4%) or 4/14 (28.6%) senile white hairs, respectively. These cells were located in the outer root sheath between the hair-bulb and the infundibulum. Silver staining was used to determine whether melanin was present within the outer root sheath of the senile white hair. Because none of the 21 white hairs tested showed specific staining within the outer root sheath, the absence of melanin was confirmed. Thus our results suggest the presence of amelanotic melanocytes within the outer root sheath of senile white hair.     

白癜风患者血清中抗酪氨酸酶IgG抗体及抗酪氨酸酶相关蛋白1 IgG抗体的检测

目的：探讨白癜风患者血清中抗酪氨酸酶IgG抗体（TYR IgG）和抗酪氨酸酶相关蛋白1 IgG抗体（TRP?1 IgG）与白癜风的关系。方法用酶联免疫吸附测定检测260例白癜风患者和50例健康对照血清中TYR IgG和TRP?1 IgG的含量。结果白癜风组TYR IgG和（或）TRP?1 IgG阳性率57.31%（149/260），TYR IgG阳性率37.3%（97/260），TRP?1 IgG阳性率33.5%（87/260），均明显高于对照组（χ2=25.441、21.630，P＜0.01）。TYR IgG阳性与TRP?1 IgG阳性不相关（r=-0.032，P＞0.05）。白癜风组TYR IgG阳性率男女间差异无统计学意义（P＞0.05），但TRP?1 IgG阳性率女性高于男性（χ2=5.811，P＜0.05）。白癜风TYR IgG阳性率≤20岁（35.9%）与＞20岁（38.3%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而TRP?1 IgG阳性率≤20岁组明显高于＞20岁组（χ2=6.498，P＜0.05）。结论检测TYR IgG和TRP?1 IgG可为白癜风的诊断和治疗提供一定依据。