乙型肝炎病毒感染者YMDD自然变异研究

目的了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中HBVP基因YMDD变异情况，并观察YMDD自然变异组与非变异组临床病情轻重的关系。方法采用PCR和荧光探针杂交检测技术，检测60例慢性乙型肝炎患者血清HBV YMDD自然变异情况。结果在60例患者中，YMDD变异阳性5例(8．33％)，阴性55例，5例变异中2例为YIDD阳性，3例为YVDD阳性。结论未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者存在YMDD自然变异株；YMDD自然变异的患者没有临床病情加重的趋势。     

基因芯片技术在检测乙型肝炎病毒 P区YMDD变异中的研究

目的 用基因芯片检测未经抗病毒治疗的HBV DNA阳性血清中HBV P区YMDD变异情况,从分子生物学角度了解YMDD两种变异的状态,为科学合理地指导临床抗病毒治疗及预测患者临床预后提供有力的依据。方法 将150份未经抗毒治疗的HBV DNA阳性血清,用PCR方法扩增P区,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸进行杂交,杂交结果通过扫描仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBVY MDD野生型及其YVDD和／或YIDD变异型结果,并对部分阳性标本用基因序列测序证实。结果 150份HBV DNA阳性血清,用基因芯片方法检出阳性标本(包括YMDD野生型和变异型)共122例,占81．3％,阴性标本28例,占18．7％;在122例阳性标本中,单纯YMDD野生型(即无变异标本)有90例,占73．8％;YVDD变异28例,占22．9％;YIDD变异2例,占1．6％;YVDD和YIDD混合变异2例,占1．60A,,变异株检出率为26．2％,而且变异株均与野生株共存。其中8份阳性标本进行基因序列测序,证实与芯片检测结果完全一致。结论(1)用当前先进的基因芯片技术检测HBVP区YMDD变异,操作简便,结果可靠,特异性高。(2)基因芯片可快速、同时、多人份检出HBVYMDD野生株及其YIDD和／或YVDD突变株的共同感染。(3)部分HBV感染者在未经抗病毒治疗情况下已自然存在HBV YMDD变异,而且变异株均与野生株共存,其中以YVDD变异为多。(4)HBV感染患者在治疗前后有必要检测是否存在HBV YMDD变异株感染,为指导临床科学合理用药和制定治疗方案提供依据。     

PCR熔解曲线法检测HBV YMDD自然变异

目的 了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎(CHB)患者乙肝病毒YMDD自然变异流行状况及特点.方法 选择未接受过抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者119例,采用荧光标记杂交双探针PCR熔解曲线法(FH-PCR-MC)对其血浆标本进行YMDD基因序列突变检测.结果 119例患者中,有23例存在YMDD自然变异毒株,变异检出率为19.3%,其中YVDD阳性者20例(87.0%),YIDD阳性者2例(8.7%),YVDD和YIDD同时阳性者1例(4.3%).23例出现自然变异毒株的患者,其体内病毒均为变异株与野生株共生,且变异株为非优势株,变异株在总病毒量中所占的比例均在50%以下.变异毒株占总病毒量的40%～50%者4例,30%～ 40%者6例,20%～30%者6例,20%以下者7例.结论 未经抗病毒治疗的CHB患者存在YMDD自然变异毒株,且变异株与野生株共生,为非优势株.     

拉米夫定与HBV-YMDD变异关系的研究

目的探讨惠州地区慢乙肝（CHB）患者拉米夫定治疗与HBV～YMDD变异的发生和发展的关系。方法选取在肝病专科就诊的176例CHB患者，在服用拉米夫定前及服药后每半年进行HBV—DNA定量及YMDD变异检测，并选取35份发生YMDD变异和10份野生型YMDD血清样本进行DNA测序。结果176例CHB患者样本中，拉米夫定治疗前检出YMDD变异7例（其中YM／YVDD型2例、YVDD型3例、YIDD型2例），变异率3．98％；治疗2年后共检出62例（其中YVDD型9例、YIDD型36例、YM／YVDD混合型9例、YM／YIDD混合型3例、YV／YIDD混合型5例），变异率35．23％。6例CHB患者在拉米夫定治疗过程中其YMDD变异类型会发生改变。结论惠州地区CHB患者经拉米夫定治疗，随着病情发展，变异类型可能会发生改变，YIDD可能是最终的变异类型，YM／YVDD、YVDD和YM／YIDD可能都是过渡的变异类型。     

未予核苷(酸)类似物治疗慢性乙型肝炎病毒感染者YMDD变异及特点

目的探讨未予核苷(酸)类似物(NA)治疗乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者P基因YMDD基序变异对于血清肝脏生化指标的影响,及YMDD变异两种形式YIDD/YVDD与HBV e抗原(HBeAg)的关系。方法采用引物特异性实时荧光聚合酶链反应(PCR)法检测慢性HBV感染者外周血HBV P基因区YIDD/YVDD变异及HBVDNA载量,并检测HBeAg、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平。结果 334例未经NA抗病毒治疗的慢性HBV感染者中,HBV未变异300例,YVDD变异23例,YIDD变异9例,YIDD、YVDD共生株2例。慢性HBV感染者HBeAg阳性与YIDD变异有关(P<0.05),与YVDD变异无关(P>0.05)。YMDD变异者与未变异者AST、ALT水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而HBV DNA比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV感染者发生YIDD/YVDD变异者,其血清ALT、AST水平均低于未变异者。HBeAg阳性者可能更易发生HBV YIDD变异,而YVDD变异可能与HBeAg状态无关。     

未经拉米夫定治疗而发生乙型肝炎病毒YMDD变异的临床分析

目的探讨未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者乙肝病毒（HBV）的YMDD基因变异情况。方法采用PCR荧光法诊断YMDD基因变异。结果84例慢性乙型肝炎HBV YMDD变异阳性17例,阴性67例。17例YMDD变异的患者中12例从未应用过抗病毒药物,5例曾行抗病毒治疗。结论未经抗病毒治疗的乙型肝炎患者亦存在较高的YMDD变异率,临床上在应用抗病毒治疗前应对患者是否存在YMDD基因变异进行检测。     

基因芯片检测HBV YMDD变异的临床应用研究

目的应用基因芯片检测慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗过程中HBV YMDD变异类型以及与抗病毒疗程的关系。方法169例接受拉米夫定治疗(100mg/d,1次/d,疗程6~36个月)的慢性乙型肝炎患者和51例未抗病毒治疗的慢性乙肝患者,采用基因芯片方法检测HBV YMDD变异,荧光定量PCR检测HBV DNA含量。所有患者HBV DNA定量值均≥5×104拷贝/ml。结果①未抗病毒治疗的51例患者检出单纯YMDD阳性(未变异)35例(71.4%),变异14例(28.6%),3种变异模式,且均与野生株并存:Y(M/V)DD(10例),Y(M/I)DD(3例),Y(M/V/I)DD(1例);②接受拉米夫定治疗的169例患者单纯YMDD阳性18例(13.7%),变异113例(86.3%),显著高于未抗病毒治疗组(χ2=57.1,P<0.01),有6种变异模式:Y(M/V)DD(39例),Y(M/I)DD(10例),Y(M/V/I)DD(16例),YVDD(15例),YIDD(22例),Y(V/I)DD(11例);③抗病毒治疗6个月YMDD变异率66.7%(22/33),以Y(M/V)DD和Y(M/I)DD为主;~12个月变异率89.3%(25/28),以Y(M/V)DD,YIDD和Y(M/V/I)DD为主;~18个月变异率85.7%(18/21),以Y(M/V),YIDD和YVDD/YIDD为主;~24个月变异率97.5%(39/40),以YVDD,Y(M/V)DD和YIDD为主;治疗>24个月者9例,变异率100.0%(9/9),以YIDD,YVDD/YIDD和Y(M/V/I)DD为主。结论基因芯片检测HBV YMDD变异方法简便,特异性高,变异模式判读直观,结果可靠。抗病毒治疗前后检测YMDD变异情况,对指导和调整抗病毒治疗方案有重要的临床应用价值。     

荧光聚合酶链反应检测HBV患者拉米夫定治疗过程中的YMDD变异

目的 建立一种在乙型肝炎拉米夫定治疗过程中产生的多聚酶酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天门冬氨酸(D)-天门冬氨酸(D)(YMDD主型区)基因变异的检测方法.方法 设计包含两个变异位点(I/V)和无变异参照位点的3条下游引物,与同一条上游引物和探针建立3管PCR反应体系,对服用拉米夫定的100位患者的300份血清通过实时荧光PCR反应后的CT值判断是否发生已知(I/V)位点的变异.结果 服药6个月检测未发现YMDD变异,服药9个月时检出YIDD变异5例,YVDD变异7例,YIDD/YVDD共同变异3例,变异率分别为5%、7%、3%.服药1年时检出YIDD变异10例,YVDD变异12例,YIDD/YVDD共同变异5例,变异率分别为10%、12%、5%,服药1年总变异率达27%.变异的发生与肝功能异常与HBVDNA病毒的反跳均相关(P＜0.05).结论 该法对乙型肝炎拉米夫定治疗引起的基因变异检测方法简便、灵敏、快速、廉价,通过联合HB-VDNA与肝功能的检测对乙型肝炎患者的抗病毒治疗有重要临床意义.     

拉米夫定治疗前后YMDD变异与HBV-DNA水平相关性分析

目的：通过对慢性乙型肝炎（CHB）患者血液中HBV—DNA、谷丙转氨酶（ALT）、r-谷氨酰转移酶（r—GT）的检测，了解CHB患者经拉米夫定（3TC）治疗前后HBV—YMDD变异情况，分析HBV—YMDD变异与HBV—DNA、ALT、r—GT相关情况，探讨3TC治疗CHB的效果以寻找最佳治疗方案。方法：对71例治疗前CHB患者，检测HBV—YMDD变异株；选择64例HBV-YMDD的CHB患者经治疗1年后，检测HBV—YMDD变异株；选择36例患者经治疗后仍然是YMDD;13例经治疗后由YMDD变为YIDD；5例治疗后由YMDD变为YVDD的；9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型的CHB进行检测HBV—DNA、ALT、r—GT含量。结果：71例CHB用3TC治疗前已有7例存在变异现象，其中2例是YVDD型；3例是YIDD型；2例是YMDD＋YVDD混合型；64例治疗前为YMDD型的患者，用3TC治疗后36例没有变异、5例变异为YVDD、13例变异为YIDD、9例变异为YMDD＋YVDD、1例变异为YMDD＋YIDD；36例治疗前后DNA没有变异的CHB，治疗前后的HBV-DNA、ALT、r—GT含量差异有显著意义；13例治疗后由YMDD变为YIDD，治疗前后的HBV—DNA含量差异有显著性，而ALT、r—GT含量在治疗前后差异无显著意义；5例治疗后由YM-DD变为YVDD和9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型，治疗前后HBV—DNA、ALT、r—GT含量差异无显著意义。结论：CHB用3TC治疗前已经存在着9.85％变异率。64例YMDD用3TC治疗1年后，有43．75％发生变异，变异的类型以YIDD为主。HBV—YMDD没有变异时，经3TC治疗CHB后患者的HBV-DNA、ALT、r—GT含量比治疗前有较大降低，效果明显。YMDD变异为YIDD时，经治疗后患者血液中的HBV-DNA含量比治疗前有较大降低，而血液中ALT、r—GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YVDD时，其血液中的HBV—DNA量高于治疗前，ALT、r-GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YMDD＋YVDD混和型时，经治后CHB患者血液中的HBV—DNA量比治疗前稍高，ALT、r-GT含量比治疗后降低不大。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生病毒学反弹患者YMDD变异分析

选取402例服用拉米夫定后出现乙型肝炎病毒(HBV)DNA反弹的慢性乙型肝炎(CHB)患者血清样品,应用荧光PCR法定性检测YMDD变异情况。402例中有309例(76.87%)检测出YMDD变异,其中120例为YVDD变异,74例为YIDD变异,115例为YVDD+YIDD联合变异;309例YMDD变异患者中同时检测出变异株与野生株占69.26%(214/309),仅检测出变异株占30.74%(95/309)。另外,93例为YMDD野生型阳性。     

乙肝拉米夫定治疗前后YMDD变异与DNA载量的关系

目的探讨原发性肝癌患者拉米夫定治疗前后HBV YMDD变异与HBV DNA复制水平的相关性,为临床治疗提供依据。方法应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术检测72例原发性肝癌患者未服用拉米夫定治疗前血清HBV DNA载量以及服用拉米夫定治疗12个月血清中YMDD突变情况。结果 72例原发性肝癌患者中,出现YMDD变异者35例（48.6%）,其中YIDD变异者28例,YVDD变异者4例,YIDD和YVDD混合变异者3例。治疗后YMDD突变组HBV DNA载量显著高于YMDD野生组,拉米夫定治疗后YIDD及YIDD＋YVDD杂合型的突变率明显增加,而对YVDD的突变率则有所降低。结论拉米夫定对原发性肝癌患者治疗前后HBV DNA复制水平无显著影响,而拉米夫定治疗后HBV DNA复制水平与YMDD突变具有相关性,可作为早期监测原发性肝癌HBV YMDD突变的观察指标之一。     

乙型肝炎病毒基因型、拉米夫定耐药突变的RFLP检测及临床相关性分析

目的对乙型肝炎（简称乙肝）肝病毒进行基因分型,检测患者服用拉米夫定后血清中乙肝病毒突变情况,并进行临床相关性分析。方法设计乙肝病毒突变及基因分型特异性引物和酶切位点,系用限制性片断长度多态性（RFLP）分析法检测突变类型并对乙肝病毒进行基因分型。结果在115份被检测的血清标本中,75份（65%）标本为野生型,18份（15.7%）标本为YIDD突变,10份（8.7%）标本为YVDD突变;在混合型突变中,YIDD+YVDD 存在于6份（5.2%）标本中,YMDD+YIDD存在于4份（3.5%）标本中,2份（1.7%）标本为YMDD+YVDD混合突变型;未检测到YSDD突变型。在180位点的突变检测中,98份（85%）标本为野生型,5份(4.3%)标本为rtL180M,L180M+M204I存在于8份(6.96%)标本中,另4份(3.5%)标本为L180M+M204V混合突变型。在115份标本中,102份标本为C基因型,13份标本为B基因型,未发现其他基因型。通过χ²检验,乙肝病毒YMDD突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P＞0.05),而乙肝病毒YMDD变异与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性（P＜0.05）,用药时间越长,发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后,180位点的突变和204位点突变具有相关性（P＜0.05）。结论采用RFLP分析法可以有效地检测乙肝病毒YMDD突变并对乙肝病毒进行基因分型。     

PCR-反向斑点杂交法检测HBV YMDD模序混合感染

目的为HBV感染临床个体化治疗、指导临床用药寻找一种能更好地检测HBV YMDD模序混合感染的方法。方法28份已知乙肝病人血清,其中10份为HBV YMDD模序感染,5份为HBV YIDD模序感染,5份为HBV YVDD模序感染,2份为HBV YMDD和YIDD模序混合感染,2份为HBV YMDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YIDD和YVDD模序混合感染,2份为HBV YMDD、YIDD和YVDD模序混合感染,都用PCR产物直接测序和PCR-流过式反向斑点杂交(Flowthrough-RDB)方法检测。结果HBV YMDD模序单一感染标本用两种方法检测准确性都达到100%,对混合感染标本PCR-流过式反向斑点杂交方法检测准确性也可达100%,然而用PCR产物直接测序方法只能检测其中一种或两种型别。结论PCR-流过式反向斑点杂交方法是一种敏感、特异和快速的检测HBV YMDD野生型及其突变型模序单一感染和混合感染的有效方法,比PCR产物直接测序更优越,更有利于实现临床个体化治疗和指导临床用药。     

乙型肝炎病毒多聚酶基因YMDD变异与临床治疗反应

目的：了解深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中HBV多聚酶基因YMDD变异的情况及其对治疗反应的影响。方法：对100例拉米夫定治疗中28例出现血清病毒核酸（HBV DNA）阳性的患者,采用限制性片段长度多态性分析法（PCR－RFLP）检测YMDD变异,并观察其血清HBV DNA及丙氨酸转氨酶（ALT）水平。结果：100例中有17例YMDD变异阳性，其中以YVDD（M550V）变异为主,占64．7％（11／17），YIDD（M550I）变异为35．3％（6／17）。发生YMDD变异的患者均伴有HBV DNA及ALT水平反跳，1例住院患者停用拉米夫定后出现病情加重。结论：深圳地区慢性乙型肝炎患者在长期拉米夫定治疗中（疗程1年，100md/d）HBV多聚酶基因YMDD变异率为17．0％（17／100）。发生变异者较无变异者疗效降低，检测YMDD变异有助于监测疗效。     

基因芯片检测拉米夫定引起的乙型肝炎病毒基因YMDD变异的研究

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)变异基因诊断芯片,对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测诊断。方法:设计特异性寡核苷酸探针。用点样法制备HBV变异基因诊断芯片。选择住院患者30例服用拉米夫定后,HBVDNA转阴[<500拷贝(opies/ml)]68周后又反跳≥5000copies/ml的患者进行基因芯片杂交检测。同时用PCR直接测序法对30例患者血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。结果:30例服药后HBVDNA反跳患者中基因芯片测得HBVYMDD变异21例,其中YVDD变异11例,YIDD变异10例。直接序列测定发现有核苷酸A741变为G,使氨基酸由蛋氨酸552变为缬氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YVDD)11例,有6例核苷酸A669变为C,使氨基酸由亮氨酸528变为蛋氨酸;核苷酸G743变为T,使氨基酸由蛋氨酸552变为异亮氨酸(氨基酸基序由YMDD变为YIDD)10例。其中有3例伴有核苷酸T781变为C,使氨基酸由亮氨酸565变为脯氨酸。其结果与基因芯片完全一致。结论:HBV变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异,同PCR直接测序法比较,准确率达100%,无假阳性。     

乙型肝炎YMDD变异与丙氨酸转氨酶乙型肝炎病毒e抗原及乙型肝炎病毒DNA的关系探讨

目的探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎期间乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的情况及其与临床的关系。方法采用通用模板信号扩增(UT-PCR)方法,对拉米夫定治疗过程中血清出现HBV DNA由阴转阳的52例慢性乙型肝炎患者进行HBVYMDD变异检测,并结合患者治疗前HBV DNA载量、丙氨酸转氨酶(ALT)水平、免疫标志物及YMDD变异后HBV DNA载量等临床信息进行结果分析。结果YMDD变异的检出率为53.85%,52例患者中,28例发生了YMDD变异,其中YIDD17例,YVDD7例,YIDD和YVDD混合变异4例。发生YIDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平显著降低(P<0.05),发生YVDD变异的患者较治疗前HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YVDD变异后的HBVDNA水平与YIDD变异后HBV DNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。YMDD变异组治疗前的ALT基础水平高于YMDD野生组治疗前水平(P<0.01),治疗前HBVDNA水平及HBeAg阳性率在变异组和野生组中差异无统计学意义(P>0.05)。结论拉米夫定治疗前ALT基础水平高可能是YMDD变异的一个易发因素。密切监控慢性乙型肝炎患者的HBV DNA及ALT水平,有利于及时发现YMDD是否发生变异。