LM23，Speedy／Ringo家族的新成员，处于生与死的十字路口

LM23是本实验窒发现的一种大鼠睾丸特异表达基因。本研究的目的在于进一步研究LM23的生物学功能。本研究使用了PROSITE~I]BLAST等生物信息学工具。为了给LM23进行亚细胞定位,通过免疫兔子,获得LM23特异的多克隆抗体。从大鼠睾丸组织克隆出LM23基因,并在大肠杆菌中表达LM23融合蛋白。使用LM23基因降调大鼠动物模型,通过基因芯片和免疫组织化学方法,分析LM23的生物学功能。结果显示,LM23属TSpeedy／Ringo家族。LM23可能调控精子发生过程中细胞周期G1／S期和G2／期转换。精子发生过程中,LM23降调可能同时激活了Fas—FasL通路和线粒体通路。这些新发现说明,LM23具有多种功能,这些功能对生精细胞的生与死的过程都具有重要作用。     

LM23基因沉默引起大鼠睾丸生精细胞凋亡

目的 研究LM23基因敲低后生精细胞的凋亡状况及与凋亡相关基因表达改变.方法 用TUNEL方法检测睾丸细胞的凋亡情况,用大鼠全基因组表达谱芯片检测LM23基因敲低后凋亡相关基因的表达改变.结果 TUNEL结果显示,LM23基因敲低侧大鼠睾丸生精小管内大量生精细胞发生凋亡.大鼠全基因组表达谱芯片分析结果显示,许多促凋亡基因如Bcl-2家族的促凋亡基因表达上调,而抗凋亡基因如Faf1和Zfp91基因的表达明显下调.结论 敲低大鼠的LM23基因,启动了Bcl-2家族介导的线粒体凋亡途径,引发了生精细胞发生大量凋亡.     

大鼠小肠移植肝脏移植物抗宿主疾病中凋亡及Fas配体的表达

目的 建立大鼠小肠移植肝脏移植物抗宿主疾病（GVHD）动物模型，探讨细胞凋亡及其Fas系统与肝脏GVHD的关系。方法 选用体重为200～250g的雄性大鼠，对照组为SD-SD大鼠（n=25），实验组为Wistar-SD大鼠（n=25），行大鼠异位全小肠移植术。分别于术后第1、3、5、7、9、11天取肝组织行苏木素-伊红（HE）染色，同时检测肝功，TUNEL法检测肝脏细胞凋亡，免疫组织化学方法检测Fas及其配体（FaSL）表达。结果 两组术后肝脏功能无明显改变，光镜及电镜亦无明显凋亡性改变。实验组，TUNEL阳性细胞从术后第4天开始出现，并且随着时间的推移呈上升趋势，而对照组无明显增加。免疫组织化学结果，两组Fas在肝脏中广泛表达；而FasL只在实验组的术后第11天广泛表达，与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 FasL和细胞凋亡可以被当作大鼠小肠移植中早期诊断肝脏GVHD的发生的有效方法之一。     

胰腺腺泡细胞凋亡和Fas/Fas配体表达在大鼠胰腺移植急性排斥反应中的作用

目的探讨大鼠胰腺移植后细胞凋亡的变化、Fas/Fas配体(FasL)的表达及其与急性排斥反应的关系。方法实验分为同基因移植组和异基因移植组。分别于术后第3、5、7天处死受体,取移植胰腺,应用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,计算凋亡指数(AI),应用免疫组织化学及Westernblot检测Fas/FasL的表达。结果细胞凋亡主要发生在胰腺腺泡细胞,同基因移植组有散在的腺泡细胞凋亡,AI在术后无明显变化,Fas/FasL表达阴性;异基因移植组在术后第3、5、7天胰腺腺泡细胞凋亡发生率逐渐增加(28.40±3.75,39.40±5.59,57.30±8.53,P<0.01),Fas/FasL表达逐渐增强,AI与急性排斥反应程度呈显著正相关(rs=0.932,P<0.01)。结论胰腺腺泡细胞凋亡和Fas/FasL表达在胰腺移植急性排斥反应中发挥重要作用,凋亡指数对胰腺移植急性排斥反应的诊断有一定的参考价值。     

补肾活血方对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸Bcl-2、Fas、FasL表达的影响

目的观察精索静脉曲张模型大鼠睾丸组织凋亡相关基因Bcl-2、Fas与FasL的表达情况，以及补肾活血方对这些基因表达的影响。方法将50只3月龄雄性SD大鼠先随机抽出10只为假手术组，其余40只大鼠采用肾静脉缩窄法建立精索静脉曲张病理模型，造模完成后再随机均分为模型组、补肾活血方低剂量组、中剂量组、高剂量组。造模完成后48d开始给药，连续给药60d，用免疫组织化学法检测各组大鼠睾丸组织凋亡相关基因Bcl-2、Fas、FasL的表达。结果模型组大鼠睾丸组织Bcl-2蛋白表达下降，Fas、FasL蛋白表达上升：补肾活血方低、中、高剂量组睾丸组织Bcl-2蛋白表达显著上升，Fas、FasL蛋白表达显著下降。结论补肾活血方可上调抑凋亡基因Bcl-2的表达，下调促凋亡基因Fas、FasL的表达，这可能是补肾活血方抑制生精细胞凋亡，改善精索静脉曲张性不育患者生精功能的机制。     

大鼠脊髓损伤急性期睾丸生精细胞凋亡及Fas和Bcl-2蛋白表达的改变

目的 研究脊髓损伤急性期对成年大鼠睾丸生精功能障碍的影响及其机制.方法 80只SD雄性大鼠随机分为脊髓损伤组(40只)和脊髓非损伤组(40只),采用原位细胞凋亡TUNEL法检测脊髓损伤后第1、2、4、8、1 6天睾丸生精细胞的形态及数量变化.采用免疫组化SABC法检测大鼠脊髓损伤后第1、2、4、8、16天睾丸生精细胞Fas、Bcl-2表达情况.结果 大鼠脊髓损伤后睾丸TUNEL标记阳性凋亡细胞第4天开始出现,多表达于初级、次级精母细胞及精原细胞,至第16d,随时间点推移阳性凋亡细胞数逐渐增多.脊髓损伤后第4～16d损伤组睾丸生精细胞Fas表达与非损伤组比较显著增强(P＜0.05),Bcl-2表达损伤组与非损伤组差别无显著性(P＞0.05).结论 大鼠脊髓损伤急性期存在睾丸生精细胞凋亡现象,睾丸生精功能障碍与Fas高表达密切相关,和Bcl-2表达无明显相关性.     

复方苦参注射液诱导胃癌细胞凋亡的机制

目的探讨复方苦参注射液对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养胃癌细胞系SGC-7901，四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定药物对SGC-7901细胞生长的抑制作用；透射电镜下观察肿瘤细胞的超微结构变化；应用流式细胞术（FCM）检测肿瘤细胞凋亡情况和Fas、FasL蛋白的表达；分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活性的变化。结果不同浓度复方苦参注射液对SGC-7901细胞生长均有一定的抑制作用。0．5g／L、1．0g／L和1．5g／L复方苦参注射液组SGC-7901细胞凋亡率分别为39．80％、58．11％和79．00％，呈明显的量效关系；复方苦参注射液组以早期凋亡细胞为主，氟尿嘧啶对照组以晚期凋亡细胞为主。Fas蛋白表达及FasL蛋白表达与凋亡均呈显著正相关：Fas蛋白表达及FasL蛋白表达之间呈显著正相关。复方苦参注射液组caspase．3酶活性随着药物浓度而升高，且酶活性变化与细胞凋亡率变化呈正相关。结论复方苦参注射液可有效诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡，其机制可能与上调Fas／FasL蛋白表达、激活caspase-3酶有关。     

凋亡相关蛋白及粘附分子在大鼠心脏急性排斥反应中的作用

目的 探讨凋亡及凋亡相关因子Fas／FasL、Bcl-2/Bax，粘附分子ICAM-1、P-selectin、E-selectin、L-Selectin、PECAM-1和VCAM-1在心脏移植中的表达及意义。方法 用免疫组织化学方法和原位杂交法，检测大鼠心脏移植后不同时间(1、3、5、7d)、Fas／FasL、ICAM-1、P-selectin、L-selectin、E-selectin蛋白、Bcl-2/Bax、VCAM-1、PECAM-1 mRNA的表达情况。结果 随着移植后天数的增加，细胞凋亡增多，Fas／FasL、Bax表达增加，粘附分子ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表达也增加，Selectin表达较少。正常大鼠肝脏未见细胞凋亡及粘附分子的表达。结论 细胞凋亡和粘附分子ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表达增加可能与心脏移植后急性排斥反应有关，而Fas／FasL、Bax可能促进了凋亡的发生。     

γ-干扰素对胆管癌细胞Fas/FasL系统调控作用的研究

目的 探索γ-干扰素（Interferon gamma,IFN-γ)对胆管癌细胞Fas/FasL系统的调控作用。方法 应用RT－PCR、Western blot、免疫组织化学、流式细胞仪和细胞培养技术，检测人胆管癌细胞株QBC939的Fas、FasL表达及相关功能，并研究IFN－γ对之的影响。结果 胆管癌细胞表达Fas、FasL基因及蛋白，并能致共同培养的Jurkat细胞发生凋亡；而IFN－γ可上调Fas、FasL基因（P＜0.01)及蛋白的表达，且调节作用呈剂量和时间依赖趋势；并能下调胆管癌细胞致Jurkat细胞凋亡的能力，在其剂量达500U／ml后更为明显。结论 IFN－γ可调控胆管癌细胞Fas/FasL系统的表达从而降低其发生免疫逃逸的能力；这为胆管癌的免疫治疗研究提供了新的资料。     

Fas/FasL和C-myc基因表达与隐睾生殖细胞凋亡的关系

目的：探讨Fas／FasL和C—myc基因表达与隐睾生殖细胞凋亡的关系，以及C—myc与Fas／FasL介导的细胞凋亡途径之间的关系。方法：采用22d龄SD雄性大鼠建立单侧隐睾模型，运用生物素—dUTP／酶标亲和素测定法检测睾丸生殖细胞凋亡，运用免疫组织化学SP法检测Fas／Fasl和C—myc基因表达。结果：①与对侧睾丸相比，术后第3天隐睾侧睾丸发生凋亡的生殖细胞无显著增加(P＞0．05)，Fas／FasL和C—myc基因表达亦无显著增加(P＞0．05)；第7天隐睾侧睾丸发生凋亡的生殖细胞显著增加(P＜0．01)；Fas／FasL和C—myc基因表达均有显著增加(P＜0．01)。②实验性隐睾术后第3天和第7天，C—myc基因表达与相应Fas／FasL基因表达间均存在着正相关关系。结论：手术诱导的隐睾生殖细胞凋亡增加；Fas／FasL和C—myc基因表达上调可能是生殖细胞发生凋亡的重要原因之一；隐睾生殖细胞凋亡可能是通过与C—myc相偶联的Fas／FasL细胞凋亡途径调控的。     

Abnormal lipid metabolism induced apoptosis of spermatogenic cells by increasing testicular HSP60 protein expression

Long-term consumption of high-fat and high-calorie foods not only causes obesity, but also may cause a decline in sperm quality in men. Rats with abnormal lipid metabolism (high-fat rats) were established by high-fat diet for 24 weeks. HE staining was used to observe the morphological changes of testis in rats, TUNEL and flow cytometer was used to detect the cell apoptosis in rat testis and in vitro. Immunohistochemistry and Western blotting were used to detect the expression of protein. After 24 weeks of high-fat food feeding, the body weight, serum lipids and number of apoptotic spermatogenic cells in the high-fat group rat were significantly higher than those in the control group. In vivo, the expression of HSP60 protein in testis of high-fat rats was positive related to apoptosis of spermatogenic cells, cleaved caspase 3/caspase 3 protein expression and Bax/Bcl2 protein expression in testis of high-fat rats. Proportion of apoptotic spermatogenic cells was increased by up-regulation of HSP60 protein expression in vitro. Long-term consumption of high-fat diets can cause high expression of HSP60 and spermatogenic cells apoptosis in rats, while HSP60 over-expression promotes spermatogenic cell apoptosis and MAPK signal pathway in vitro.     

通精灵对实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞凋亡及Bcl-2表达的影响

目的：探讨实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡状况及通精灵对精索静脉曲张大鼠睾丸生精功能的保护作用。方法：成年清洁级雄性Wistar大鼠50只,按Sapyol法制作左精索静脉曲张大鼠模型,随机分为假手术组、模型组、通精灵低剂量组、通精灵中剂量组、通精灵高剂量组各10只。造模1个月后,各组予以不同药物灌胃1次／d。2个月后处死,用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法检测睾丸生精细胞凋亡,免疫组化法检测睾丸组织Bcl-2表达。结果：模型组大鼠左睾丸凋亡指数明显高于假手术组及通精灵各组（P〈0．01）,通精灵各组左睾丸凋亡指数显著低于模型组（P〈0．05）。与假手术组比较,模型组大鼠睾丸组织Bcl-2蛋白表达下降（P〈0．05）,与模型组比较,通精灵中、高剂量组睾丸组织Bcl-2蛋白表达显著上升（P〈0．05）。结论：通精灵能降低实验性精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞凋亡,减轻实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织的病理损害,上调凋亡抑制基因Bcl-2表达。     

燃煤型氟中毒大鼠诱导型一氧化氮合酶蛋白表达、血清睾酮与生精细胞凋亡的相关性研究

目的:研究燃煤型氟中毒大鼠睾丸组织诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达、血清睾酮(T)与生精细胞凋亡的相互关系,探索燃煤型氟中毒对睾丸生殖功能损伤的机制。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、低氟组、中氟组、高氟组。各染毒组喂饲含不同比例的燃煤型氟中毒病区煤烘玉米的饲料,建立雄性大鼠燃煤型氟中毒模型。分别于染毒4和6个月后以股动脉放血法处死大鼠,各时间点每组处死大鼠5只。采用RIA法测定大鼠血清T水平;检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、iNOS活性;原位缺口末端标记(TUNEL)法检测大鼠睾丸生精细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI);免疫组织化学染色SP法观察iNOS蛋白表达的变化。结果:成功建立雄性大鼠氟中毒模型。大鼠血清T水平在4和6个月时低氟组[(28.37±0.19)nmol/L、(14.68±0.36)nmol/L]、中氟组[(25.85±0.23)nmol/L、(9.08±0.31)nmol/L]、高氟组[(23.63±0.29)nmol/L、(4.89±0.54)nmol/L]较对照组[(29.77±0.43)nmol/L、(29.97±0.36)nmol/L]均降低(P0.05或P0.01),且各染氟组间差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。睾丸生精细胞AI在4和6个月时低氟组(8.83±1.64、10.40±2.70)、中氟组(17.24±3.96、22.20±3.96)、高氟组(44.21±7.85、49.60±4.77)较对照组(0.46±0.11、0.54±0.11)升高(P均0.01),且各染氟组间差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。睾丸组织iNOS蛋白表达的OD值在4和6个月时低氟组(0.073 3±0.008 5、0.108 4±0.012 6)、中氟组(0.142 5±0.027 2、0.207 7±0.020 4)、高氟组(0.527 5±0.079 1、0.717 3±0.065 6)较对照组(0.001 3±0.000 2、0.001 6±0.000 1)增加(P0.05或0.01),且各染氟组间差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。iNOS蛋白表达量与生精细胞AI呈正相关(r=0.962,P0.01);血清T水平与生精细胞AI呈负相关(r=-0.744,P0.01)。结论:血清T水平改变和睾丸组织iNOS蛋白表达调控改变可能参与燃煤型氟中毒对睾丸生殖功能损害的过程。     

LM23 is a novel member of the Speedy/Ringo family at the crossroads of life and death of spermatogenic cell

LM23 is a gene specifically expressed in the testis of Rattus norvegicus, as previously reported by our laboratory. The aim of the study is to further investigate the biological function of LM23. Several bioinformatic tools were utilized, including PROSITE and BLAST. To determine the subcellullar localization of LM23, a polyclonal antibody specific for LM23 was generated via the immunization of rabbits. The LM23 gene was cloned from rat testis tissue, and LM23 protein was expressed in Escherichia coli. The biological function of LM23 was analyzed with microarray analysis and immunohistochemistry, using a rat model of LM23 gene knockdown. The results suggested that LM23 belongs to the Speedy/Ringo family. LM23 regulated the G₁/S and G₂/M transitions of the cell cycle during spermatogenesis. Downregulation of the LM23 gene during spermatogenesis could lead to the activation of both the Fas–FasL pathway and the mitochondrial pathway. These novel findings indicate that LM23 has a diverse array of functions that are important in both the life and death of the spermatogenic cell.     

低温联合地塞米松对大鼠睾丸扭转复位后ICAM1表达的影响及生精功能的保护作用

目的:探讨低温联合地塞米松对大鼠睾丸扭转复位后的生精功能的保护作用,以及对细胞间粘附分子1(ICAM1)表达的影响。方法:将100只青春期的雄性SD大鼠(体重140~160 g)随机分为4组,每组25只。4组大鼠分别扭转左侧睾丸720°2 h,建立单侧睾丸扭转动物模型,各组做如下处理,A组:常温+生理盐水;B组:低温+生理盐水;C组:常温+地塞米松;D组:低温+地塞米松;术后48 h采集睾丸,通过HE染色光镜观察睾丸组织病理学改变、TUNEL法检测睾丸生精细胞的凋亡、Western印迹检测ICAM1的表达。结果:HE染色光镜下见4组大鼠扭转侧睾丸组织均有不同程度损伤,其中A组睾丸损伤最为明显,其余3组扭转侧睾丸得到不同程度保护;睾丸组织ICAM1 Western印迹检测结果:A组扭转侧(左侧)睾丸组织ICAM1蛋白表达量(0.68±0.03)高于B组(0.49±0.06)、C组(0.46±0.09)、D组(0.17±0.08),差异具有显著性(P0.05、P0.05、P0.01);凋亡细胞染色:细胞核呈深棕黄色或棕褐色,A组扭转侧睾丸可见大量生精细胞凋亡,凋亡指数AI[(33.13±3.21)%]明显高于B组[(17.12±5.23)%](P0.05)、C组[(14.13±2.03)%](P0.05)及D组[(9.05±1.03)%](P0.01)。结论:低温联合地塞米松能显著增强睾丸组织抗损伤能力,较好地保护扭转复位后睾丸的生精功能及降低ICAM1的表达。     

兔抗大鼠LM23蛋白合成肽多克隆抗体的制备与初步应用

目的制备大鼠精子发生相关蛋白LM23的合成肽多克隆抗体,对其特性进行初步鉴定,并对LM23多克隆抗体进行初步应用。方法利用生物信息学方法分析选择LM23蛋白的多肽序列。应用Fmoc法化学合成大鼠LM23蛋白N端第1～20和第274-291个氨基酸多肽（接近C端）,经C18的RP—HPLC纯化后,通过高碘酸钠法,将纯化的LM23蛋白的多肽与KLH交联,免疫新西兰大耳白兔,获得LM23蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法鉴定多克隆抗体效价。通过Westernblot方法鉴定LM23多克隆抗体的特异性并研究LM23在大鼠睾丸中的表达;通过免疫组化方法研究LM23在大鼠睾丸组织和细胞中的定位。结果化学Fmoc法分别合成大鼠LM23蛋白N端第1～20,第274-291个氨基酸多肽,纯化后两条多肽纯度都达到90％以上,符合免疫用抗原标准。将多肽与KLH交联,用于免疫动物。经ELISA鉴定,两种多克隆抗体的效价分别达到1：64000和1：128000。应用大鼠睾丸组织切片进行LM23—18肽多克隆抗体的免疫组织化学研究,发现精母细胞有阳性颗粒反应,且LM23主要表达于细胞核。Westernblot研究证实,LM23—18肽多克隆抗体可特异识别大鼠睾丸组织中相对分子萤（Mr）约为36kD的LM23蛋白。结论所制备的LM23合成肽多克隆抗体可用于ELISA、Westernblot及免疫组化研究。LM23合成肽多克隆抗体的制备为进一步研究LM23的功能和作用机制提供了有力支持。     

精子发生阻滞不育患者睾丸雌激素受体α的表达

目的:探讨雌激素受体α(ERα)在睾丸的表达与精子发生阻滞的关系。方法:用HE染色技术检查120例不育症患者睾丸活检标本,其中精子发生阻滞患者标本应用免疫组化法检查ERα的表达,并以10例健康人睾丸组织作为对照。结果:120例标本中符合精子发生阻滞病理诊断标准者有31例(占25.8%)。正常健康人睾丸组织中,ERα在睾丸支持细胞、类肌细胞和间质细胞的细胞核内表达,生精上皮细胞不表达;而在精子发生阻滞的睾丸组织中,ERα也在睾丸支持细胞、类肌细胞和间质细胞的细胞核内表达,但表达较弱,生精上皮细胞不表达。两者表达强度存在显著性差异(P<0.05)。结论:雄激素与雌激素通过各自的受体发挥协调作用而共同促进精子发生。精子发生阻滞可能与包括雄激素受体、ERα及热休克蛋白90在内的一系列复杂的细胞信号转导障碍有关。