γδ T细胞与CD4+T细胞产生IFN-γ动力学的比较研究

目的通过比较分析γδT细胞和CD4^＋T细胞IFN-γ合成动力学,以深入了解γδT细胞产生IFN-γ特点。方法应用流式细胞技术分离技术分选出初始γδT细胞和初始CD4^＋T细胞。在此基础之上,通过定量RT—PCR技术检测γδT细胞和CD4^＋T细胞在不同刺激条件下IFN-γ基因特录情况。结果对比CD4^＋T细胞,γδT细胞产生IFN-γ不但需要更少的刺激信号以及更低的刺激域值,并且能更快地达到峰值。结论γδT细胞有加速产生IFN-γ的动力学特点。     

Foxp3基因转染对人CD4+CD25-T细胞表型和功能的影响

目的探讨体外Foxp3基因表达对CD4^＋ CD25^-T细胞功能的影响。方法将编码人Foxp3基因全长的逆转录病毒表达载体，转染人外周血CD4^＋CD25^-T细胞。以流式细胞仪方法检测转染后CD4^＋CD25^-T细胞表面CD25、CDl27分子及CTLA4分子的表达变化，以流式细胞仪及RT—PCR检测Foxp3基因在转染细胞中的表达。体外刺激、观察转染后的Foxp3细胞的增殖反应，以及重组细胞对CD4^＋CD25^-T细胞增殖反应和细胞因子分泌的作用。结果转染后Foxp3基因在CD4^＋CD25^-T细胞中呈高水平表达。转染细胞表面CD25、CTLA4分子均呈高水平表达，而CDl27分子表达水平下降，且IL-2并不能诱导其增殖。转染细胞与CD4^＋CD25^-T细胞共同培养可有效抑制CD4^＋CD25^-T细胞的增殖反应及细胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ的分泌。结论Foxp3基因转染可有效诱导CD25及CTLA4分子表达，并使转染细胞具有调节性T细胞的功能。     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。     

MtbAg体外激活扩增的人γδT细胞表面L-选择素的动态变化

目的: 研究结核杆菌抗原(MtbAg)激活扩增的人外周血γδT细胞表面L-选择素(CD62L)的表达。方法: 用MtbAg和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC)促使γδT细胞增殖,用CD3单克隆抗体(CD3mAb)和rIL-2刺激人PBMC促使αβT细胞增殖。取新鲜PBMC和刺激后培养3~21天的γδT细胞和αβT细胞,用多色荧光抗体标记,在流式细胞仪上检测γδT细胞表面CD62L的表达,并与αβT细胞作比较。结果: 新鲜未刺激PBMC中γδT细胞CD62L表达率为43.9%,明显低于αβT细胞的76.6%;用MtbAg或CD3Ab激活后培养第6天时CD62L在γδT细胞的表达(90.7%)和在αβT细胞表达(87.2%)均达到高峰;以后CD62L表达逐渐下降,15~21天γδT细胞CD62L的表达在低水平(16.2%~10.6%)维持,αβT细胞表面的CD62L表达(23.6%~17.5%)亦在低水平维持。结论: 新鲜PBMC中γδT细胞CD62L表达明显低于αβT细胞,但在激活后增殖过程中CD62L在γδT细胞的表达,与αβT细胞相似,呈现先上升再下降的趋势,最后稳定在低水平。     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖动力学研究

目的：探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导的新生儿脐带血CD8^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性。方法：新生儿脐带血单个核细胞经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）标记后,加入TGF-β1,同时用CD3mAb激活和IL-2培养扩增。培养第4、6、8天收集细胞,用流式细胞术检测活化增殖后的CD4^＋CD25^＋、CD8^＋T细胞增殖动力学变化。结果：培养后第6、8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞增殖指数分别为11.52、23.04,高于对照组CD4^＋CD25^＋T细胞（6.68,10.46）及实验组CD8^＋T细胞（4.23,5.43）。培养后第8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为52.74%,在各代中以第8代所占比例最高,而对照组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为36.26%;实验组CD8^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为13.54%,在各代中所占比例最高的为第2代,而对照组CD4^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为29.44%。结论：TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性明显强于CD8^＋T细胞。     

不同结核杆菌抗原刺激外周血T细胞亚群产生干扰素的比较

目的：比较磷酸化抗原（HDMAPP）、结核杆菌耐热抗原（Mtb-HAg）和结核杆菌低分子耐热抗原Mtb-HAg（10 k）刺激外周血T细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）的反应能力方面的特点及差异.方法：采集正常人外周血,分别用HDMAPP、Mtb-HAg和Mtb-HAg（10 k）刺激培养14 h,再加入莫能霉素继续培养6h,收集细胞,加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色,然后在流式细胞仪上检测各实验组中CD3＋ αβ细胞和CD3＋ γδ细胞胞内IFN-γ的表达.结果：正常人各抗原实验组CD3＋ αβ细胞和CD3＋γδ细胞胞内产生IFN-γ＋细胞比率较阴性组对照组升高（P＜0.01）.各抗原刺激组CD3＋γδ细胞产生IFN-γ＋细胞比率明显高于CD3＋αβ细胞（P ＜0.05 ～P＜0.01）.3种抗原刺激组间CD3＋αβ细胞和CD3＋γδ细胞无明显不同（P＞0.05）.结论：HDMAPP、Mtb-HAg和Mtb-HAg（10 k）均可以刺激外周血中T细胞中αβ和γδ细胞群产生IFN-γ,均可特异性诱导刺激CD3＋γδ细胞产生IFN-γ,HDMAPP、Mtb-HAg（10 k）对CD3＋γδ细胞产生IFN-γ的表达量高于Mtb-HAg.     

唑来膦酸刺激人外周血单个核细胞体外扩增γδT细胞及其在肝癌非特异性免疫中的作用

目的探讨唑来膦酸刺激人外周血γδT细胞的增殖作用,同时测定增殖后的γδT细胞对人肝癌细胞的杀伤效能。方法以不同浓度的唑来膦酸联合IL-2刺激健康人外周血γδT细胞增殖。以流式细胞仪检测相关表型,3H-TdR掺入法测定细胞增殖程度。以γδT细胞作为效应细胞,分别以不同人肝癌细胞作为靶细胞。以SRB法测定效应细胞对靶细胞的杀伤效能。结果外周血γδT细胞增殖明显,唑来膦酸为1μmol/L浓度时,γδT细胞增殖最明显。所得γδT细胞对3种肝癌细胞均表现出明显的杀伤作用。结论唑来膦酸能明显促进人外周血γδT细胞的增殖,且扩增的γδT细胞在体外对肝癌细胞有显著的杀伤作用。     

CD69在人外周血活化的γδT细胞表面的表达

目的:观察CD69在人外周血γδT细胞表面的表达及与γδT细胞活化的关系.方法:抗CD3单克隆抗体及结核杆菌低分子多肽刺激人外周血单个核细胞(PBMC)及纯化的T细胞,流式细胞仪检测不同时相γδT细胞表面CD69分子的表达率.结果:抗CD3单抗、Mtb抗原刺激PBMC后3h,γδT细胞表面即表达CD69,24h达高峰;单独抗CD3或Mtb抗原刺激纯化的T细胞,CD69分子表达升高不明显,加入激发型抗CD28单抗作为第二信号,CD69表达率明显升高.结论:CD69分子在活化的γδT细胞表面高表达,可作为γδT细胞完全活化的一个指标.     

乙醇及二甲基亚砜对人γδT细胞和αβ细胞凋亡与细胞活性的影响

目的　观察不同浓度的乙醇及二甲基亚砜 (DMSO)对人γδT细胞和αβT细胞凋亡与细胞活性的影响。方法　分别用结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb Ag)、CD3单抗(CD3mAb)刺激正常人外周血单个核细胞 ,分别获得Mtb Ag激活的T细胞 (αβT细胞为主 )及CD3mAb激活的T细胞(γδT细胞为主 ) ;用不同浓度的乙醇及二甲基亚砜分别作用于γδT细胞和γδT细胞 4、2 4h后 ,应用Annexin V FITC/PI染色 ,流式细胞术检测不同T细胞亚群的凋亡 ,应用四唑盐(MTT)法检测T细胞的活性。结果　Mtb Ag激活的T细胞中γδT细胞比例可达 70 %～ 90 % ;CD3mAb激活的T细胞中γδT细胞比例 >90 % ;与对照组相比 ,除浓度为 1 0 %及 2 0 %的DMSO作用于γδT细胞 2 4h的诱导凋亡作用明显 (P <0 0 5 )及浓度为 2 0 %的DMSO作用于γδT细胞 4h对细胞活性抑制明显 (P <0 0 5 )外 ,低浓度乙醇及DMSO(≤ 2 0 % )对人γδT细胞和γδT细胞的诱导凋亡作用及对细胞活性的抑制作用均无显著性 (P >0 0 5 ) ;与对照组相比 ,除 5 0 %乙醇作用于γδT细胞 4h及 5 0 %DMSO作用于γδT细胞 4h诱导细胞凋亡作用不明显 (P >0 0 5 )外 ,高浓度乙醇和DMSO(5 0 % )对γδT细胞和γδT细胞的诱导凋亡作用及对细胞活性的抑制作用均增加 (P <0 0 5 )。结论     

小儿类风湿关节炎患者外周血CD4+、CD8+ T细胞CD69表达及意义

目的分析小儿类风湿关节炎（RA）患者的外周血CD4^＋、cDB^＋T细胞CD69表达水平，探讨其在小儿关节炎症发生过程中的免疫病理作用。方法收集32例RA患儿和30例健康儿童外周血标本，利用流式细胞仪检测CD4^＋、cD8^＋T细胞CD69表达，分析它们在疾病发展过程中的作用。结果RA患儿外周血CD4^＋、CD5^＋T细胞CD69表达明显升高，与健康者比较有统计学差异（P〈0．05），所有患儿均接受了有效的药物治疗，待症状控制后，分析发现患者的CD4^＋、CD8^＋T细胞表达CD69水平显著下降（P〈O．05）。结论RA患儿外周血T细胞表达CD69水平明显升高，提示T细胞在关节炎症病变过程中激活、增殖，参与关节滑膜组织及全身免疫应答。     

T细胞亚群及共刺激分子表达与系统性红斑狼疮免疫病理的关系

目的：探讨T细胞亚群及共刺激分子表达与系统性红斑狼疮免疫病理的关系。方法；采用免疫荧光标记技术和流式细胞仪检测技术对系统性红斑狼疮（SLE）患者和正常人外周血T细胞亚群及外周血单个核细胞膜表面共刺激分子的表达进行分析。结果：（1）与正常人相比，SLE患者CD3^ ,CD4^ T细胞亚群显著减少，CD4／CD8比例失调，双标记CDr^ CD28^ ,CD8^ CD28^ T细胞亦显著减少；（2）患者共刺激分子CD28表达显著降低，4－1BB分子表达显著增高；（3）患者T细胞CD4／CD8与抗核抗体呈负相关，共刺激分子4－1BB与抗核抗体，尿蛋白呈正相关，而与CD4^ CD28^ T细胞亚群呈负相关。结论：T细胞亚群及共刺激分子表达异常在系统性斑狼疮发病机制中可能具有重要作用。     

2型糖尿病患者外周血中调节性T细胞的改变

在正常外周血中,CD4^＋CD25^＋T细胞占CD4^＋T细胞的5%-10%,表面组成性表达CD25（IL-2Rα）,CTLA4（CD152）,GITR和CD62L[1]。这群细胞具有免疫无能性,对于T细胞受体刺激不产生增殖反应;同时具有免疫抑制性,可以抑制CD4＋或CD8＋T细胞的增殖反应,因此这群细胞参与了许多自身免疫性疾病的发生。现有的研究表明在1型糖尿病中CD4^＋CD25^＋T细胞存在数量的减少和功能的减退。     

CD69在慢性乙肝患者CD4+、CD8+T淋巴细胞的表达

目的：观测慢性乙肝患者外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞早期激活标志CD69的表达.方法：静脉采集慢性乙肝患者普通肝素抗凝血2 ml,在植物血凝素（PHA）20μg/ml条件下进行全血培养,4 h后用双色免疫荧光标记流式细胞术检测CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞CD69的表达。结果：正常人外周血只有很少量CD4^＋与CD8^＋T淋巴细胞表达CD69分子,经PHA刺激后CD4^＋与CD8^＋T淋巴细胞CD69的表达率明显升高,较刺激前有统计学差异（P＜0.01）。同样,慢性乙肝患者在激活前后也有统计学差异（P＜0.01）;慢性乙肝患者在PHA刺激前有一部分CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞表达CD69分子,明显高于对照组（P＜0.01）。结论：本研究结果可能与乙肝患者体内病毒免疫紊乱有关系。     

胰腺癌患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞分析

目的：探讨胰腺癌患者外周血高表达CD25的CD4＋调节性T（CD4^＋CD25^highT）细胞比率变化特点及其临床意义。方法：用流式细胞术检测58例胰腺癌患者和14名健康人外周血CD4^＋CD25^highT细胞水平,进行分层分析,初步探讨其表型特征。结果：胰腺癌患者外周血中CD4^＋CD25^highT细胞占CD4^＋T细胞的百分比率为（15.61±13.97）%,明显高于健康人群（2.53±1.26）%（P〈0.01）;CD4＋CD25highT细胞具有调节性T细胞的表面标记特征,即HLA-Ⅰ、CD45 RO阳性,CD45 RA、CD69阴性。人白细胞DR抗原的表达水平在不同个体间的CD4^＋CD25^highT细胞差异较大。这群细胞细胞膜表面共刺激分子CD80、CD86表达水平很低,而共刺激分子CD152（CTLA-4）在不同个体间的CD4^＋CD25^highT细胞差异较大。胰腺癌Ⅰ-Ⅱ期患者,其外周血CD4^＋CD25^highT细胞占CD4^＋T细胞的比率为（18.75±20.76）%;Ⅲ期为（13.71±9.53）%;Ⅳ期为（14.20±7.46）%;各期CD4^＋CD25^highT细胞占CD4^＋T细胞的比率均显著高于健康人群水平（P〈0.01）。结论：胰腺癌患者外周血CD4^＋CD25^highT细胞水平明显升高,可能与肿瘤免疫功能低下及肿瘤发生、发展密切相关。     

同种抗原特异性T淋巴细胞克隆方法的建立

目的 建立抗原特异性T淋巴细胞克隆的方法。方法 以供体脾细胞作同种抗原,刺激受体外周血单个核细胞,用有限稀释法进行T淋巴细胞克隆。结果 获得3个T淋巴细胞株。经免疫组化分析,有2个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^ 。另一个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^-。后者经流式细胞仪分析纯度为97％。抗原特异性检测表明：用供体细胞刺激,克隆T细胞发生增殖作用;用无关个体细胞刺激,无增殖作用。结论 成功地建立了抗原特异性T淋巴细胞克隆方法。     

新生儿脐带血T细胞亚群的流式细胞仪检测

目的：检测我国新生儿脐带血T细胞亚群的变化.方法：使用全自动血液分析仪进行血常规检测;荧光素标记的抗CD4/抗CD8/抗CD3和抗CD4/抗CD25/抗CD3单克隆抗体对血液细胞表面分子进行免疫荧光染色,用流式细胞术进行各细胞亚群计数和分析.结果：新生儿脐带血中红细胞（RBC）计数、血红蛋白（Hb）含量、白细胞（WBC）计数、淋巴细胞百分比与成人外周血有显著性差异.新生儿脐带血组中CD3^＋T细胞、CD3＇CD4^＋T细胞、CD3^＋CD8^＋T细胞、CD4^＋CD8^＋T细胞、CD4^＋CD25^high调节性T细胞、CD4^＋CD25^intT细胞、CD4^＋CD25^-T细胞绝对计数及其在各自细胞亚群中的百分比均存在显著性差异.结论：中国正常新生儿脐带血与成人外周血的RBC、Hb、WBC及T细胞亚群检测结果存在显著性差异,这与新生儿免疫机制发育不完全是相符合的.     

人BAFF-R-IgG4mut融合蛋白对BXSB狼疮鼠CD4~＋T细胞增殖活性的影响

目的观察人BAFF-R-IgG4mut融合蛋白对BXSB狼疮鼠CD4＋T淋巴细胞增殖活性的影响。方法体外分离、纯化BXSB狼疮鼠脾脏CD4＋T细胞,流式细胞技术检测CD4＋T细胞BAFF-R表达,MTT法观察不同剂量BAFF-R-IgG4mut融合蛋白对BAFF刺激的CD4＋T细胞增殖活性的影响。结果台盼蓝染色分离后的BXSB狼疮鼠脾脏CD4＋T细胞活性率为（93.6±3.2）%;流式细胞技术检测BXSB狼疮鼠脾脏CD4＋T细胞表达BAFF-R;100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml BAFF-R-IgG4mut蛋白作用于BAFF和CD3抗体刺激的CD4＋T细胞后,CD4＋T细胞增殖抑制率分别是56.24%、67.07%和75.45%,较单纯BAFF＋CD3抗体组差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 BAFF-R-IgG4mut融合蛋白可体外抑制BXSB狼疮鼠CD4＋T细胞增殖活性。     

17β-雌二醇对小鼠淋巴结、脾脏和胸腺调节性T细胞及其Foxp3表达的影响

目的：研究小鼠去卵巢及体内注射17β-雌二醇（E2）后，淋巴结、脾脏和胸腺CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（regulatory Tcell，Treg细胞）及相关调节性因子Foxp3表达的变化与E2的相关性。方法：采用流式细胞仪检测CD4^＋CD25^＋Treg细胞功能相关因子Foxp3的表达，CD4^＋CD25^＋T和CD4^＋CD25^＋high T细胞数量的变化。结果：E2抑制淋巴结中Treg细胞Foxp3的表达．上调其在脾脏和胸腺中的表达；E2下调淋巴结中CD4^＋CD25^＋T细胞和CD4^＋CD25^＋high T细胞的比例，上调它们在脾脏尤其是胸腺中的比例。结论：E2对淋巴结、脾脏和胸腺3种免疫器官中的Treg细胞有不同的调节作用。