斑马鱼髓系造血细胞缺陷突变体的大规模遗传筛选

目的 通过大规模化学遗传学方法筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体.方法 利用化学诱变剂乙基亚硝基脲(ENU)将雄鱼精原母细胞诱变,通过与AB野生型雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同founder(FO)的F1代同胞之间交配产生F2家族,F3代来F2家族同胞内交配,并分别以中性红和苏丹黑B染色筛选巨噬细胞和粒细胞缺陷突变体.结果 我们筛选了350个F2家族,共1424对鱼.初步筛选到6个斑马鱼髓系造血系统的突变体,其中3个突变体为中性红染色异常,另3个突变体为苏丹黑染色异常,表明以上突变体可能存在巨噬细胞或粒细胞的发育障碍.结论 ENU化学诱变和中性红及苏丹黑B染色筛选斑马鱼髓系造血缺陷突变体是简单、价廉、有效的化学遗传学方法.通过保留突变体对后代进行进一步的研究分析,有望鉴定和克隆影响斑马鱼髓系造血新的基因或已知基因的新的调控途径.     

斑马鱼红系造血缺陷突变体的正向遗传学筛选

目的 化学遗传学方法 大规模筛选并初步鉴定所获得具有不同红系造血缺陷表型的斑马鱼突变体.方法 乙基亚硝基脲(ENU)诱导雄性斑马鱼突变(founder),将其与野生型AB雌性斑马鱼交配产生F1代,源自不同来源的founder的F1代杂交产生F2家族.在F2代同家族内自交所产生的F3代胚胎中,用以βe1为探针,实施整体原位杂交实验,进行红系造血缺陷突变体筛选,并针对所筛选到的突变体在不同造血过程缺陷表型进行分类研究.结果 和结论 筛选得到4个βe1基因表达缺失突变体,其中2个为红系特异性造血缺陷突变体,另外2个突变体同时存在红系和淋系造血缺陷.     

一种新的斑马鱼cloche突变体亚型的基因鉴定

目的斑马鱼cloche172突变体的基因鉴定。方法采用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱变雄性野生型AB斑马鱼,实施大规模正向遗传学方法筛选髓系细胞标记物lysozymeC(lyC)表达缺失突变体,并对其中一个名为cloche172突变体进行大体形态学观察,基因定位克隆和遗传学互补实验。结果大规模正向遗传学筛选出4个lyc表达缺失突变体,其中一个cloche172突变体受精后3d(day post fertilization,dpf)时期大体形态改变与已知但基因不明的cloche突变体相似。遗传学互补实验观察到有1/4胚胎出现类似cloche突变体的表型。同时,cloche172突变体基因定位在13号染色体近端粒的区域,与cloche突变体基因定位区域一致。而o-dianisdine实验证实cloche172突变体有较多红细胞聚集,cloche突变体仅有少量在尾部存在。结论cloche172基因与cloche基因定位一致,cloche172突变体是一个新的点突变位点的cloche突变体。     

伴有三系病态造血的原发性急性髓细胞白血病研究

<正>伴有三系病态造血改变的原发性急性髓细胞白血病(TMDS+AML)是AML的一种亚型.目前国外报道很少,国内尚未见报道.我研究室通过对137     

24例伴有三系病态造血改变的急性髓细胞白血病的临床观察

目的：观察伴有三系病态造血改变的急性髓细胞白血病（TMDS（＋）AML）的临床特点。方法：1997年－2001年24例MDS（＋）AML与对照组的临床分析。结果：TMDS（＋）AML的发生率为11．1％，以M6多见，其红细胞、白细胞、外周血和骨髓中原始细胞分比，治疗后完全缓解率等均较低。结论：TMDS（＋）AML具有独特形态学和预后特征。     

初发急性髓细胞白血病伴三系病态造血的实验室检查及临床意义

近年来 ,提出粒、红、巨三系病态造血的初发急性髓细胞白血病 (ＡＭＬ -ＴＭＤＳ) ,并认为是急性白血病的一种特殊类型。我们对 2 71例初发ＡＭＬ进行回顾分析 ,其中 31例为ＡＭＬ -ＴＭＤＳ。对其临床、实验室特征 ,治疗及其预后进行了总结 ,报道如下。1　材料和方法1.1　一般资料　 1986年 1月～ 2 0 0 0年 10月 ,资料完整的ＡＭＬ2 71例 ,检出 31例ＡＭＬ -ＴＭＤＳ。男 19例 ,女 12例 ,男女比例为 1.5 8:1。年龄 8～ 71岁 ,平均 45 .6岁。1.2　ＡＭＬ -ＴＭＤＳ诊断标准[1] 　 1)粒系 :中晚幼粒及成熟中性粒细胞至少 5 0 %以上有少颗粒…     

二十二碳六烯酸对视网膜光感受器细胞超微结构影响的实验研究

目的观察二十二碳六烯酸（DHA）对大鼠视网膜光感受器细胞超微结构的影响。方法 14只雌性SD大鼠随机分成正常组、造模组、DHA组,灌胃15d后造模,分别在造模后12h、24h和48h处死动物,取眼球行电镜观察。结果腹腔内注射一定量的MNU可以明显损伤视网膜光感受器细胞的超微结构。而DHA可抑制MNU对视网膜光感受器细胞超微结构的损伤。结论 DHA对视网膜光感受器细胞有较好的保护作用,有望成为一种延缓视网膜色素变性病程进展的有效药物。     

髓系细胞触发受体在肺泡巨噬细胞上的表达

目的 研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)后,在不同的时间点髓系细胞触发受体1(triggering receptors expressed on myeloid cells 1,TREM1)、髓系细胞触发受体2(TREM2)蛋白的表达情况,并探讨其在AM介导的炎症反应中的作用及机制. 方法 体外培养肺泡巨噬细胞,分为正常对照组和LPS干预组.对照组不予处理,干预组给予100 ng/ml LPS.之后对照组在0 h,LPS干预组分别在3 h,6 h,12 h,24 h用ELISA检测AM培养上清液中TNF-α表达水平,流式细胞术检测上述不同时间点TREM1,TREM2蛋白的表达水平. 结果 LPS干预AM后,TNF-α的表达在3 h达到最高[(36.58±2.14)pg/ml],之后下降,24 h时接近正常.TREM1的表达在3 h上升到最高(113.19±10.14),之后下降,24 h时接近正常.TREM2的表达3 h下降到最低(119.74±2.58).TREM1与TNF-α的表达高度正相关(r=0.825,P<0.001);TREM2与TNF-α的表达高度负相关(r=-0.779,P<0.001). 结论 TREM1,TREM2可能在LPS致AM介导的炎症反应中起重要作用.     

急性髓系白血病干细胞源性巨噬样细胞生物学特性的研究

目的 探讨急性髓系白血病干细胞(acute myeloid leukemia stem cells,AML LSCs)分化成AML LSCs源性巨噬样细胞的生物学现象、生物学特点及潜在的病理学意义.方法 分选AML细胞系Kasumi-3中AML LSCs,在巨噬细胞条件培养基中培养14 d,从形态学、免疫表型、分泌细胞因子、吞噬功能等角度鉴定获得的贴壁细胞,明确AML LSCs源性巨噬样细胞的基本生物学特点.检测与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞表面耐药蛋白水平、胞内化疗药物浓度和对柔红霉素(DNR)的摄药量,初步评价AML LSCs源性巨噬样细胞促进白血病耐药的作用及可能机制.结果 培养获得的AML LSCs源性巨噬样细胞呈多形性,以多角形和椭圆形贴壁细胞为主,透射电镜观察发现细胞呈椭圆形,胞浆丰富,有较多空泡;近胞核处高尔基体富集;包膜绒毛丰富且较长.AML LSCs源性巨噬样细胞特异性表达CD11b、CD163、CD206,分泌一定水平IL-10和IL-13.细菌吞噬实验证明其可吞噬大量呈绿色杆状荧光的E.coli菌,随着孵育时间的延长,吞噬数量逐渐增多.激光共聚焦显微镜观察发现与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞表面ABC转运蛋白表达明显强于对照组,DNR摄药量低于悬浮培养Kasumi-3细胞(54.75±4.28vs93.84±3.93,P＜0.01),对DNR、阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-C)和足叶乙甙(VP-16)均有一定的耐药性.结论 AML LSCs在特定条件下可以分化成为AML LSCs源性巨噬样细胞,后者有类似巨噬细胞的生物学特性,参与白血病耐药的形成.     

造血干细胞移植患者骨髓单个核细胞幼红巨噬细胞黏附蛋白表达的探讨

目的 研究造血干细胞移植(HSCT)患者骨髓造血功能与幼红巨噬细胞黏附蛋白(EMP)表达的关系.方法 抽取46例HSCT患者移植前(HSCT前组)及移植后30、90、180 d(HSCT后30、90、180 d组)骨髓3～5 mL,另选10例健康骨髓捐献者作为正常对照组,分离骨髓单个核细胞.用RT-PCR和Western blot法检测EMP核酸和蛋白的表达,分析EMP表达与骨髓造血功能之间的关系.结果 各实验组均可检测到EMP mRNA表达,其中HSCT前组EMP mRNA表达最低,红系造血岛数量最少.正常对照组和HSCT前组未检测到EMP蛋白.HSCT后各组均检测到EMP蛋白,结果无明显差异(P>0.05),其EMP mRNA表达水平和红系造血岛数量均明显高于HSCT前组和正常对照组(P<0.05).结论 EMP的表达与红系造血岛的数量有关,在评价骨髓造血功能时有一定的应用价值.     

斑马鱼模型在新精神活性物质代谢研究中的应用

斑马鱼具有体型小、易于饲养、繁殖成本低、繁殖率高等诸多优势,是药物代谢研究的新型模式生物。本文概述斑马鱼代谢模型的构建,介绍斑马鱼模型的基因与人类高度相似性以及其发达的酶系统、较低的基质效应等优点;总结斑马鱼模型在合成大麻素类、芬太尼类、哌嗪类、合成卡西酮类等各类新精神活性物质研究中的应用;综述斑马鱼中体内常见的代谢反应包括Ⅰ相（氧化、N-脱甲基、O-脱乙基化、羟化和N-脱烷基）和Ⅱ相（硫酸化和葡萄糖醛酸化）反应,说明其代谢物种类与真实人体体液样本之间的差异主要和酶的种类有关,指出斑马鱼模型在研究新精神活性物质方面的巨大潜力和进一步研究趋势。     

成年斑马鱼牙齿发育的形态学观察

目的:观察成年斑马鱼牙齿的生长部位和形态.方法:以成年斑马鱼(鱼龄>3个月)为研究对象,在体视显微镜下,解剖成年斑马鱼腮弓,对其牙齿进行活体观察,并做石蜡切片和HE染色观察.结果:成年斑马鱼牙齿位于第五腮弓上,每条腮弓上牙齿数量不等.牙齿外形呈三角形,为端生牙,无牙根.三角形牙齿的底部附着于腮弓上,三角形牙齿的尖即为牙尖,朝向内侧咽部,左右牙尖相对.HE染色显示成年斑马鱼的牙齿为钙化结节样物质,类似人牙齿的牙本质结构.结论:对斑马鱼牙齿组织形态和发育过程的进一步研究将有利于寻找到一种良好的研究牙齿组织发育的模式动物.     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立

目的 探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法 构建肝脏特异启动子fabp10启动rtTA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rtTA,联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒转染HeLa细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rtTA联合pTRE-Tight-BI-AcGFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30礸/ml doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果 共转染pfabp10-rtTA与 pTRE-Tight-BI-AcGFP1的HeLa细胞经1礸/ml浓度doxycycline诱导培养液诱导, GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30礸/ml doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具     

凋亡诱导因子和突变型p53在胃癌前病变组织及胃癌组织中的表达及其相关性研究

目的探讨凋亡诱导因子(AIF)与突变型p53(mp53)在胃癌前病变组织及胃癌组织中的表达及其相关性。方法胃癌根治术切除标本及胃镜活检标本125例,其中20例正常胃黏膜标本,42例低级别上皮内瘤变胃黏膜标本,23例高级别上皮内瘤变胃黏膜标本,40例胃癌组织标本,采用免疫组织化学染色技术检测各组的AIF及mp53的表达情况。结果 AIF在正常胃黏膜、低级别上皮内瘤变胃黏膜、高级别上皮内瘤变胃黏膜及绝大多数胃癌细胞胞质中表达,在少数胃癌细胞胞核中表达;mp53均在细胞核内表达。AIF与mp53的表达无相关性(P>0.05)。AIF和mp53在低级别上皮内瘤变胃黏膜、高级别上皮内瘤变胃黏膜及胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜(P<0.01)。结论 AIF和mp53异常表达可能在胃癌发生发展过程中发挥作用。AIF蛋白表达量升高和p53基因发生突变在胃癌发生过程中均是早期事件。AIF在胃癌发生过程中可能执行氧化还原酶和细胞凋亡的双重功能,对其分子作用机制的深入探讨可能为胃癌的早期诊治提供新的思路。     

带信号肽人胰岛素原突变体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建带信号肽人胰岛素原突变体的真核表达载体并在COS-7细胞表达出成熟的人胰岛素.方法:采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),将普通细胞内furin蛋白酶的识别和切割位点Arg-X-Lys-Arg-样序列,引入人胰岛素原C肽两端,同时加上信号肽、Kozak序列和限制性内切酶的酶切位点并克隆至载体pcDNA3.1( )中,构建成人胰岛素原突变体的真核表达载体,经测序验证后转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹、放射免疫法检测其在COS-7细胞中的表达.结果:DNA测序结果表明在预期位点突变符合要求,经RT-PCR、Western印迹、放射免疫鉴定,构建的人胰岛素原突变体的真核表达载体转染的COS-7细胞可表达、分泌人成熟胰岛素.结论:构建了人胰岛素原突变体的真核表达载体,并成功地在COS-7细胞中获得人胰岛素的分泌表达.     

人端粒酶RNA突变体酵母三杂交诱饵质粒的构建

目的 对人端粒酶RNA进行多位点的突变并构建该突变体的酵母三杂交诱饵质粒,且进行毒性检测.方法 根据人端粒酶RNA(hTR)序列及突,变位点设计引物,运用重叠延伸PCR法埘hTR基因的第41位、第80位及第102位碱基进行T→A突变,将突变后的片段克隆入PMD18T载体.经测序正确后再亚克隆到酵母三杂交诱饵质粒PRH3′中,PCR及酶切鉴定.鉴定成功的重组诱饵质粒转化到酵母细胞L40ura3/pHyblex/ZeoMS2进行毒性检测.结果 经过测序验证,该基因预期位点突变成功且其他序列未发生随机突变,重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主无毒性.结论 成功构建了hTR突变体的重组质粒PRH3′-hTRm,可作为酵母三杂交系统中的"诱饵".     

大鼠肝癌变中p53点突变及其蛋白表达的研究

目的 研究大鼠肝癌变中突变型P53蛋白（mP53）的表达及p53基因第6外显子点突变。方法 通过DEN诱发的启动模型和肝癌模型,应用免疫组化、MDT－PCR－SSCP和直接测序技术分别研究mP53表达和53基因第6外显子点突变。结果 mP53阳性细胞仅见于癌前个别肝细胞增生结节中,8／18例（44．44％）肝细胞癌呈mP53阳性;8例mP53阳性肝癌中仅有1例（12．50％）被检出p53基因第6外显子发生点突变,即第208位密码子第1碱基G→G填换。结论 在DEN诱发的启动模型和肝癌模型中p53基因突变可发生于大鼠肝癌变之癌前及肝癌形成阶段,且第6外显子突变率低。