大鼠牙髓干细胞的分离培养与鉴定

目的:分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定.方法:采用酶消化法分离获得大鼠牙髓干细胞,有限稀释法纯化细胞,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,抗波形丝蛋白及角蛋白、抗STRO-1免疫化学染色.体外分化诱导实验检测细胞的多向分化能力.结果:分离纯化获得的大鼠牙髓干细胞在体外具有一定的克隆形成能力,波形丝蛋白、STRO-1均有表达.诱导条件下部分牙髓干细胞具有多向分化的潜力,符合干细胞特征.结论:成功从大鼠牙髓中获取牙髓干细胞.     

体外培养乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞 定向分化的实验研究

目的 研究体外培养乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞的定向分化。方法 选取南方医科大学口腔医 院29 例健康儿童的滞留乳牙，在4 h 内进行乳牙牙髓干细胞的原代提取。采用免疫磁珠分选法进行细胞分选， 并对分选出的细胞进行特定的血管内皮细胞定向诱导。对乳牙牙髓干细胞及血管内皮细胞定向诱导后的细胞进 行镜下形态观察、血管生成实验，以及免疫表型鉴定。结果 镜下形态观察显示，经过血管内皮定向诱导的乳牙 牙髓干细胞呈典型血管内皮细胞的形态特征；血管生成实验表明，经过血管内皮定向诱导的乳牙牙髓干细胞可 呈现明显的血管样结构；免疫表型鉴定显示经过血管内皮定向诱导的乳牙牙髓干细胞血管内皮细胞表面抗原呈 阳性。结论 乳牙牙髓干细胞可定向分化为血管内皮细胞。     

人乳牙牙髓干细胞的体外培养和鉴定

目的 从健康儿童滞留的乳牙牙髓组织中分离出乳牙牙髓干细胞(SHED),体外培养观察,研究其生物学特性.方法 用酶消化法培养SHED,观察细胞形态、克隆形成能力,以免疫组化和流式细胞技术检测多种抗原表达情况及细胞周期,并进行体外分化实验,诱导SHED形成脂肪组织及矿化结节.结果 以酶消化法分离培养所得的细胞多形性明显,克隆形成效率为16~18/103细胞,其中富含有表达STRO-1表型的细胞.在一定条件下,所培养细胞具有定向分化能力.结论 以酶消化法分离培养获得的细胞中,包含自我更新能力强、有一定分化能力的干细胞,即SHED.     

犬根尖牙乳头干细胞的分离培养和生物学特性

的：分离培养比格犬（Beagle犬）根尖牙乳头干细胞并研究其生物学特性。方法：拔除Beagle犬上颌年轻恒前牙,切取根尖牙乳头,采用酶消化法分离培养Beagle犬根尖牙乳头细胞,进行成纤维细胞克隆形成实验、生长曲线测定、多向分化能力研究及间充质干细胞相关表面标记物STRO-1、CD146和CK的表达分析,并将其移植至免疫缺陷鼠皮下观察矿化组织的形成。结果：Beagle犬根尖牙乳头组织中存在一群具有高度增殖能力的细胞,在相同培养条件下,其克隆形成率明显高于人根尖牙乳头干细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）;所获得Beagle犬根尖牙乳头干细胞具有成骨、成脂和成软骨等多向分化能力;在体外经成骨诱导后可形成矿化结节,成脂诱导后可形成脂滴,成软骨诱导后免疫组织化学染色Ⅱ型胶原阳性表达;同时该群细胞STRO-1和CD146阳性表达,而CK阴性表达;与羟基磷灰石混合移植于免疫缺陷鼠皮下可形成矿化组织和牙髓 牙本质复合体样结构。结论：Beagle犬根尖牙乳头中存在具有高增殖能力和多向分化能力的根尖牙乳头干细胞。     

人类年轻恒牙牙髓干细胞体外多向分化的能力

目的:从人类的年轻恒牙中分离、培养牙髓间充质细胞,并探讨其基本的干细胞生物学特性及体外的多向分化能力.方法:对人类的正畸减数年轻恒前磨牙中分离培养的牙髓细胞进行相差显微镜和透射电镜观察,利用流式细胞仪分析牙髓间充质细胞表型特征和细胞周期时相,并在体外进行定向诱导.结果:从年轻恒牙牙髓中分离培养得到的牙髓间充质细胞为成纤维样;细胞器发育较好;有间充质干细胞的表面特征:CD90,CD44和CD147阳性细胞的比例很高,CD34,CD38,CD45和 HLA-DR的阳性比例很低;有很强的增殖生长能力;经体外诱导年轻牙髓细胞可在体外向成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞分化,但不能被诱导成为软骨细胞.结论:从人类年轻恒牙牙髓中可以分离培养得到的牙髓间充质干细胞,具有较高的增殖能力和间充质干细胞表面特征,在体外诱导下能分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元,具有多向分化的潜能.     

人脱落乳牙牙髓干细胞与人恒牙牙髓干细胞成骨分化及破骨能力的差异

目的比较处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSCs）的成骨分化及破骨能
力,探讨两者在成骨和破骨相关分子的表达情况。方法体外分离、培养和纯化处于生理性根吸收时期的自然脱落乳牙牙髓干
细胞与恒牙牙髓干细胞;两种干细胞在成骨诱导14 d 和21 d,分别进行ALP染色、茜素红染色,并通过Real-time PCR检测
SHED和DPSCs矿化诱导后的成骨与破骨相关基因表达。结果倒置显微镜下观察,SHED和DPSCs形态均为长梭形;两种干
细胞经矿化诱导后,茜素红染色可见SHED的矿化结节计数多于DPSCs（P<0.05）,SHED的ALP活性亦强于DPSCs（P<0.05）。
RT-PCR检测结果显示,经矿化诱导后两种干细胞均表达成骨与破骨相关基因Runx2、OCN、ALP、OPG和RANKL,但DPSCs的
Runx2、OCN 和ALP的表达水平均低于SHED（P<0.05）,且SHED反应细胞破骨/成骨能力的RANKL/OPG 的比值显著高于
DPSCs（P<0.05）。结论与DPSCs相比,SHED不仅具有较强的成骨分化能力,还兼有较强的破骨能力,为SHED参与生理性根
吸收骨改建的调控机制提供实验依据。
     

两种分离胎盘间充质干细胞方法的比较

目的：寻找从胎盘组织中分离培养间充质干细胞的最佳方法。方法：分别采用外植块贴壁法和酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞,并对其形态、免疫表型、生长动力检测和多向分化能力进行检测。结果：流式细胞术和诱导分化实验表明酶液消化法分离得到的贴壁细胞表型符合间充质多能干细胞特征,且在合适诱导条件下能向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化,而外植块贴壁法获得的贴壁细胞弱表达CD29和CD105,仅能向脂肪细胞分化。结论：酶消化法可有效的从胎盘组织中分离间充质干细胞,增殖能力强,具备多向分化能力。     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

人牙髓干细胞和根尖乳头干细胞体外分化能力的对比研究

目的 对比研究人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP)的体外生长特性、增殖及矿化能力.方法 采用酶消化法体外培养人DPSCs和SCAP,诱导分化培养基诱导细胞成骨/成牙本质向分化,流式细胞仪检测特异性标记物,茜素红染色检测矿化程度,逆转录PCR(RT-PCR)检测分化标记物表达.结果 人DPSCs和SCAP为成纤维细胞样贴壁生长,SCAP增殖率较高;两种细胞表达特异性间充质干细胞(MSCs)标记物:CD34、CD45(-),CD90、CD105、CD146(+),基质细胞抗原1(STRO-1)、八聚体转录因子4(OCT-4)(+),SCAP特异性标记物CD24(+).成骨诱导3周可形成明显钙化结构,SCAP钙化能力较强.成骨诱导2周2种细胞均可表达分化标记物:骨涎蛋白、骨钙素、牙本质涎磷蛋白,且随诱导时间表达逐渐增加.结论 人DPSCs和SCAP均具有间充质干细胞典型特征,可分化为成牙本质样细胞,是牙源性组织工程的可靠于细胞来源.     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人牙髓干细胞,构建人牙髓干细胞系.方法 采用组织块酶消化法获取原代细胞,通过有限稀释克隆法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;分别进行矿化诱导和成脂诱导,观察诱导后细胞矿化结节和脂滴形成情况.结果 原代培养后5～7d有细胞从组织边缘爬出,有限稀释法获得相对纯化均一的牙髓干细胞;流式细胞仪分析细胞表面抗原,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;矿化诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成.结论 分离所得的细胞具有人牙髓干细胞的生物学特性,成功构建人牙髓干细胞系.     

大豆苷元对人乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的 探讨大豆苷元对人乳牙牙髓干细胞(SHED)增殖和分化的影响.方法 对体外培养的第3代SHED用浓度分别为0.1、1、10、100 μM的大豆苷元培养基进行培养,采用MTT法检测细胞生长曲线,通过碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、放免法和TGF-β1 Elisa试剂盒检测大豆苷元对SHED碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OCN)以及TGF-β1表达的影响.结果 0.1 μM的大豆苷元能够显著促进SHED的增殖,而高浓度(100μM)的大豆苷元则对SHED的增殖具有明显的抑制作用.大豆苷元剂量依赖性地促进了SHED ALP、OCN和TGF-β1的表达.结论 大豆苷元对SHED的增殖和成骨分化具有促进作用,其促成骨分化机制可能与增加TGF-β1表达有关.     

人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性的实验研究

目的研究人乳牙牙髓干细胞体外成骨特性。方法从健康儿童滞留乳牙牙髓组织中分离培养乳牙牙髓干细胞(SHED)后,经流式细胞仪分选出两组细胞。A组:CD34+/CD117+双阳性表达的细胞,B组:剩余的混杂细胞。研究两组细胞各自成骨特性:运用流式细胞仪分选标记干细胞,以免疫细胞化学技术,荧光定量PCR技术检测成骨细胞标记物,并做矿化染色。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样生长,经分选的A、B两组细胞在第30天时免疫细胞化学检测发现均有成骨细胞的标记物RUNX-2、OC、BSP表达,在培养第40天时运用荧光定量PCR检测分析发现A、B两组细胞表达RUNX-2、OC、BSPmRNA基因水平的差异有显著性意义:A组高于B组;在第50天A、B两组细胞运用VonKossa's染色法和茜素红染色法检测,结果显示A组细胞呈阳性表达,B组细胞呈阴性表达。结论纯化后的CD34+/CD117+双阳性表达的SHED具有体外自行成骨特性。     

比塔派克斯糊剂在儿童乳前牙根管治疗术中的应用

目的观察比塔派克斯(vitapex)注射型根管糊剂在儿童乳前牙根管治疗术中的疗效,及替牙时牙根的吸收情况。方法对29例36颗乳前牙进行根管治疗,采用比塔派克斯糊剂充填根管,术后观察2-3年,了解根管治疗术后情况及替牙时牙根的吸收情况。结果36颗乳前牙,根管治疗成功34颗,失败2颗,成功率94.4%。治疗成功的34颗乳前牙,替牙时牙根有效正常吸收的有32颗,不吸收和吸收少于根管1/3但不影响恒牙正常萌出的有2颗。结论比塔派克斯注射型根管糊剂在儿童乳前牙根管治疗术中效果良好,并在替牙时期随牙根吸收而不影响恒牙的正常萌出,可推广使用。     

乳牙釉质化学元素的微量分析

目的分析乳牙釉质化学元素的分布规律,为临床防龋提供依据。方法收集22例儿童26颗健康无龋乳牙进行牙釉质化学元素分析。结果不同性别及年龄段儿童乳牙釉质化学元素含量之间差异无统计学意义（P〉0．05）。钙、磷、镁、氯、氟、锶、锌的含量随深度增加而减少,各深度含量差异有统计学意义（P〈0．05）,均与深度呈负相关（P〈0．05）,钠、铝、钛的含量在乳牙釉质中分布均匀,各深度含量差异无统计学意义（P〉0．05）。结论乳牙釉质各元素与年龄、性别无相关性。其中钙、磷、镁、氯、氟、锶、锌、铝、钛与乳牙釉质矿化程度和抗龋性有关。     

西藏小型猪乳牙牙体的组织结构特性

目的探索西藏小型猪乳牙牙体及牙胚的组织病理结构特性,为牙齿相关疾病及牙再生研究奠定基础。方法通过X线拍 摄西藏小型猪乳牙牙牙合系统结构,扫描电镜观察其乳牙牙釉质及牙本质超微结构,采用Micro-CT对乳牙进行扫描,Mimics软 件对颌骨及牙齿进行三维重建,进一步应用Image J 软件计算灰度值及计算乳牙矿化密度值,通过HE染色了解西藏小型猪牙 胚及牙髓组织结构特点。结果西藏小型猪乳牙牙冠由牙釉质、牙本质及牙髓组织构成。乳牙牙釉质和牙本质超微结构与人类 乳牙较一致,牙釉质和牙本质矿化密度值分别为2.47±0.09 g/cm3和1.72±0.07 g/cm3,牙胚和牙髓组织病理结构与人类牙齿结构 也较一致,乳牙牙髓组织处于未分化状态。结论西藏小型猪的乳牙解剖、超微结构、组织病理结构均与人类相似,是研究人类 牙体组织疾病发病及牙再生机制理想的动物模型。     

乳下前牙融合牙对继承恒牙的影响

目的 探讨乳下前牙融合牙对恒牙的影响。方法 对临床76例乳下前牙融合牙患儿进行临床及X线检查，观察融合牙位、继承恒牙缺失情况、恒牙列形成及继承恒牙形态。结果 乳下前牙融合牙单侧好发，侧切牙与尖牙（BC）融合为57．89％，中切牙与尖牙（AB）融合为39．47％；继承恒牙缺失率61．84％，且均为侧切牙；AB融合与BC融合发生继承恒牙缺失率差异（P〉0．05）无统计学意义；无间隙乳牙列乳下前牙融合，继承恒牙缺失发生率（77．08％）高于有间隙乳牙列乳下前牙融合者（P〈0．05）；乳下前牙融合牙无继承恒牙缺失者均出现恒下前牙拥挤；恒牙缺失组可出现继承恒牙近远中径增大。结论 乳下前牙融合牙对继承恒牙及恒牙列均有影响。     

TGF-β1介导人乳牙牙髓干细胞分化为血管平滑肌细胞的研究

目的 血管化的主要方案是先生成血管组成细胞(血管内皮细胞和血管周细胞),然后将这些细胞构建成血管结构.由于受体自身内皮细胞和血管平滑肌细胞的稀缺性和异质性,限制了其在血管组织工程学中的广泛运用.因此,本研究对于人乳牙牙髓干细胞(SHED)是否能够诱导分化成为功能性血管平滑肌细胞(vSMCs)进行了相关方面的研究.方法 利用转化生长因子(TGF)-β1作为刺激因子,诱导SHED分化为vSMCs.完成诱导后,通过RT-PCR、流式细胞术分析、Western blot和免疫荧光技术检测基因和特异性蛋白表达情况.此外,借助Matrigel血管生成功能实验来验证SHED来源的vSMCs是否能行使平滑肌细胞的功能.结果 通过分析平滑肌细胞特定标志物(如a-SMA、SM22a、 Calponin和SM-MHC)的表达,证实了 TGF-β1可以诱导 SHED分化为vSMCs,且流式细胞术证实分化的效率处于较高的水平,其标志物表达比例高达α-SMA 86. 1％,SM22α 93. 9％, Calponin 56. 8％,SM-MHC 88. 2％.体外 Matrigel 血管生成功能实验表明,由SHED诱导分化的vSMCs在稳定由人脐静脉血管内皮细胞所形成的血管结构中发挥着与原代 vSMCs相似的作用.结论 在血管组织工程中,SHED可以成功地诱导为vSMCs,能够成为血管组织工程中一种有前景的种子细胞.